[发明专利]Beclin1蛋白乙酰化和突变的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生理学和分子生物学领域，具体为Beclin1乙酰化的应用。

背景技术

蛋白质翻译后修饰十分重要，通过亚基的加减改变蛋白质的空间结构，从而影响其功能和相互作用，甚至影响蛋白质本身的稳定性。常见的蛋白质翻译后修饰包括磷酸化、泛素化、乙酰化、糖基化等等，这些修饰决定着一些重要蛋白的活性，在多数生理代谢通路中起着分子开关的作用。乙酰化是指在蛋白质翻译完成后，通过乙酰基转移酶在蛋白质N端残基上增加乙酰基的修饰。乙酰化在蛋白质功能和结构的稳定性中起着重要的作用。组蛋白、p53、tubulin等蛋白均存在乙酰化状态，在其乙酰化状态，染色质蛋白和代谢相关酶高度集中，提示乙酰化修饰对基因表达和代谢具有相当大的作用。在细菌中，和中心代谢有关的蛋白质90％以上是被乙酰化的，提示乙酰化修饰的范围十分广泛。乙酰化修饰一般发生在赖氨酸(K)，而在电荷状态上来看，精氨酸(R)和去乙酰化的氨基酸相似，因此，常用赖氨酸→精氨酸突变(KR突变)来模拟去乙酰化状态。通常情况下，乙酰化反应和去乙酰化反应是由组蛋白乙酰转移酶(HAT)和去乙酰化酶(HDAC)催化的，虽然HAT和HDAC被称为组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶，但实际上他们也可以对非组蛋白进行乙酰化和去乙酰化的修饰。

自噬(Autophagy)是存在于真核生物中的普遍生命现象,是机体适应外界环境改变、维护内环境稳态的重要途径。基础研究表明，自噬有可能和糖尿病、肥胖等内分泌代谢疾病之间存在联系。作为自噬相关基因之一，Beclin1在自噬的发生中扮演着重要的角色，广泛参与组织细胞的生理代谢过程。

尽管Beclin1在自噬中的作用至关重要，其翻译后修饰也在近年来备受关注，但截至目前，关于Beclin1翻译后修饰的研究并不多。相对来讲研究最多的是Beclin1的磷酸化修饰，有报道称死亡相关蛋白death-associatedproteinkinase(DAPK)可磷酸化Beclin1蛋白BH3域中的Thr119位点，促使Beclin1与BCL2/BCL-XL解离，游离状态的Beclin1增多，自噬过程激活。

除了磷酸化，Beclin1的泛素化也被确定报道过。Beclin1的泛素化修饰是通过泛素K63标记的，TRAF6是Beclin1的泛素化修饰酶并鉴定出2个Beclin1的TRAF结合结构域，位于Beclin1蛋白BH3结构域中的K117位点是K63的主要泛素化结合位点，即是Beclin1最主要的泛素化位点。在巨噬细胞给予炎症因子刺激或氨基酸剥夺，可通过TRAF6介导促使Beclin1泛素化，而后与Bcl-2解离，激活自噬途径，而去泛素化酶A20可有效拮抗TRAF6的自噬激活作用。抑制泛素特异性肽酶USP10和USP13对Beclin1的去泛素化作用，可以促使Beclin1和Vps34复合物降解，从而抑制自噬发生。

从现有报道看，Beclin1存在磷酸化和泛素化修饰，且这两种修饰均直接影响了Beclin1介导的自噬过程。然而，Beclin1是否可以被乙酰化尚不清楚。

发明内容

本发明旨在用乙酰化调控Beclin1蛋白的表达，以及调控Beclin1蛋白所介导的自噬。

用去乙酰化酶抑制剂可以使Beclin1发生乙酰化，从而增加Beclin1的表达量，提高自噬水平。

Beclin1K416位点可以被乙酰化的概率非常之高，采用点突变技术对Beclin1K416位点进行了负义突变，即由赖氨酸突变为精氨酸(KR突变)，从而构建了K416R突变型质粒。将该突变型质粒转染293T细胞后，其乙酰化水平有部分降低，但依然存在较明显的乙酰化条带。即使如此，Beclin1的表达及LC3的表达显著降低，从而抑制了自噬的发生。

本发明确定了Beclin1可以被乙酰化。结果显示，ACE-Beclin1处条带明显存在，且随着去乙酰化酶抑制剂NAM+TSA(NT)的作用时间延长不断加深，约在6小时处条带最为明显。由此，Beclin1存在乙酰化状态，可以被乙酰化。