[发明专利]利用水杨酸诱导铁皮石斛生产石斛碱的方法

说明书

技术领域

本发明提供一种利用水杨酸诱导铁皮石斛生产石斛碱的方法，属于生物技术领域。

背景技术

生物碱是石斛属植物最主要的生理活性成分之一，其药理活性的强弱与生物碱含量有一定的关系。对铁皮石斛的石斛碱生物学功能和药理药效研究表明它是安全健康的天然活性产物，主要具有增强机体免疫力、抗癌、降血压、以及镇静和止痛作用。

铁皮石斛在自然条件下繁殖率低、生长缓慢、被过度采挖利用以及生态环境的破坏，导致野生资源濒临灭绝，限制了石斛碱生产和进一步开发利用。随着组织培养技术的日趋成熟，国内外学者利用组织培养技术进行铁皮石斛的快速繁殖，以提高繁殖系数，解决资源紧缺的问题，但离体培养的石斛原球茎、组培苗等的石斛碱含量和化学组成及作用等方面与野生石斛相当，仍不能有效解决石斛资源短缺的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种技术工艺简单易行、廉价高效且能显著提高铁皮石斛生产石斛碱效率的利用水杨酸诱导铁皮石斛生产石斛碱的方法。其技术方案为：

一种利用水杨酸诱导铁皮石斛生产石斛碱的方法，其特征在于采用如下步骤：

(1)制备铁皮石斛组培苗：铁皮石斛种子播撒于1/2MS培养基表面，在温度23～25℃，光照强度1500～1700lx，光暗比为10h/14h条件下培养至苗高3～4cm，获得诱导培养的铁皮石斛组培苗；

(2)诱导铁皮石斛的石斛碱积累：用0.1％的无水乙醇溶液溶解水杨酸，配制成浓度为5mmol/L的水杨酸母液，将水杨酸母液添加到1/2MS培养基中至水杨酸终浓度为145～155μmol/L；然后将铁皮石斛组培苗转苗到上述添加了水杨酸母液的1/2MS培养基，在26～28℃、相对湿度66～68％、光强1800～2000lx、光暗比为12h/12h条件下培养29～31天。

所述的利用水杨酸诱导铁皮石斛生产石斛碱的方法，其特征在于：步骤(1)中，培养基采用添加30g/L蔗糖的1/2MS培养基，石斛种子采用浙江雁荡山铁皮石斛种子。

本发明与现有技术相比，其优点是：在组织培养中施加了少量的水杨酸，大幅提高了铁皮石斛中石斛碱的积累效率，具有投资少、效果显著、方便易行的特点，对于降低石斛碱的生产成本、满足石斛碱的大规模生产具有重要意义。

具体实施方式

实施例1：

步骤1、制备铁皮石斛组培苗：采用浙江雁荡山铁皮石斛种子，播撒于添加30g/L蔗糖的1/2MS培养基表面，在温度23℃，光照强度1500lx，光暗比为10h/14h条件下让种胚分化成芽，日光灯下培养至铁皮石斛无菌苗高度约3～4cm，即获得诱导培养的铁皮石斛无菌苗。

步骤2、诱导铁皮石斛积累石斛碱：水杨酸采用美国西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司生产的水杨酸。先用0.1％的无水乙醇溶液溶解水杨酸，配制成浓度为5mmol/L的水杨酸母液，将水杨酸母液添加到含30g/L蔗糖的1/2MS培养基中，至水杨酸终浓度为145μmol/L，然后将石斛组培苗转苗到上述添加了水杨酸母液的1/2MS培养基，与空白对照组同时在26℃、相对湿度66％、光强1800lx、光暗比为12h/12h条件下培养31天。

实施例2：

步骤1、制备铁皮石斛组培苗：采用浙江雁荡山铁皮石斛种子，播撒于添加30g/L蔗糖的1/2MS培养基表面，在温度24℃，光照强度1600lx，光暗比为10h/14h条件下让种胚分化成芽。日光灯下培养至铁皮石斛无菌苗高度约3～4cm，即获得诱导培养的铁皮石斛无菌苗。

步骤2、诱导铁皮石斛积累石斛碱：水杨酸采用美国西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司生产的水杨酸。先用0.1％的无水乙醇溶液溶解水杨酸，配制成浓度为5mmol/L的水杨酸母液，将水杨酸母液添加到含30g/L蔗糖的1/2MS培养基中，至水杨酸终浓度为150μmol/L，然后将石斛组培苗转苗到上述添加了水杨酸母液的1/2MS培养基，与空白对照组同时在在27℃、相对湿度67％、光强1900lx、光暗比为12h/12h条件下培养30天。

实施例3：

步骤1、制备铁皮石斛组培苗：采用浙江雁荡山铁皮石斛种子，播撒于添加30g/L蔗糖的1/2MS培养基表面，在温度25℃，光照强度1700lx，光暗比为10h/14h条件下让种胚分化成芽。日光灯下培养至铁皮石斛无菌苗高度约3～4cm，即获得诱导培养的铁皮石斛无菌苗。