[发明专利]人神经干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种利用无血清培养基贴壁培养神经干细胞并定向诱导分化成多巴胺能神经元的方法。

背景技术

众所周知，造成帕金森症的主要原因是中脑黑质及纹状体中多巴胺能神经元的退行性减少导致的多巴胺神经递质的减少。现行的治疗方法主要是外源性的补充多巴胺前体物质(如L-dopa)以及应用某些多巴胺受体激动剂或类似的一些药物。此类方法的治疗结果并不稳定，容易导致严重的后遗症，并不能从根本上解决问题。治疗帕金森症最理想的方式应该是刺激中脑黑质及纹状体内源性的多巴胺能神经元生成或者是外源性的多巴胺能神经元细胞替代整合至病灶并发挥功能，终止其神经退行性病变甚至修复其受损部位，恢复其功能。

鉴于成人脑部神经干细胞数目有限，并且病灶部位组织受损，刺激其生成新的神经元难度巨大；而外源性的细胞可以通过体外扩增的方式进行大量增殖、分化，利用精确的定位手术进行移植，并且由于中枢神经系统特有的血脑屏障的存在，神经干细胞与多巴胺能神经元的移植几乎不会引起任何的免疫排斥反应。因此，细胞替代治疗为帕金森症患者的治疗提供了一种新的途径，并极有希望在接下来的几十年内替代现有的药物治疗成为帕金森治疗最有效的治疗方式。

通过不断的技术改进，现阶段人们已经能够便捷地获得数量丰富的用于临床试验的神经干细胞，但是却缺乏有效的方法将神经干细胞高效地诱导成多巴胺能神经元细胞用于临床细胞移植治疗帕金森症。Néstor F.Díaz等用鼠胚胎干细胞生产多巴胺能神经元，免疫组化染色分析显示，有94％胚胎干细胞分化成多巴胺能神经元前体细胞，神经元细胞中有26％为多巴胺能神经元细胞。Michela Deleidi等用鼠神经干细胞诱导分化多巴胺能神经元细胞，免疫组化分析显示，未处理的神经干细胞分化为多巴胺能神经元的分化率为40.5±0.5％，而用VPA处理神经干细胞后，其分化率高达62.5±4％。目前国外还没有直接将人神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元的相关报导。国内谢佐平、罗小丹等用鼠神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元细胞，其分化率分别为40％、50.97％。吴卫江等、王莎莉等用人神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元细胞，其分化率分别为14.73％、15.2％。Xuan Wang等使用forsklin和FGF8来诱导人胎脑神经前体细胞分化为多巴胺能神经元，结果显示分化率显著增高，但由于培养基中使用了胎牛血清(BSA)，而无法用于临床。使用本发明的方法，人神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元细胞的分化率高达70％，解决了帕金森症临床治疗上多巴胺能神经元来源的问题，为其治疗提供了新的途径。

发明内容

本发明提供了一种利用无血清培养基贴壁培养神经干细胞并使其定向诱导分化成多巴胺能神经元的方法，该方法同时解决了目前多巴胺能神经元诱导效率偏低、诱导过程使用血清影响临床使用等问题。

本发明利用无血清培养基贴壁培养神经干细胞并使其定向诱导分化成多巴胺能神经元的方法通过以下方式进行实施：

本发明的一种将人神经干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法，其包括如下步骤：

步骤1：人神经干细胞的贴壁培养：用无血清培养基将人神经干细胞按照5×10⁴/mL的浓度制成细胞悬液，接种至层粘连蛋白(Laminin，LN，购于Lifetechnologies公司)包被的培养器皿中，35℃培养箱中静置培养24-48小时；

步骤2：多巴胺能神经元前体细胞的诱导：换用多巴胺能神经元前体细胞诱导液，此诱导液由无血清培养基添加细胞因子SHH、FGF8b、CHIR99021组成，35℃培养箱中静置培养7-10天，每3天换液；

步骤3：多巴胺能神经元细胞的定向诱导：换用多巴胺能神经元细胞定向诱导液，此诱导液由神经细胞培养基Neurobasal Medium添加B27、BDNF、GDNF、TGFβ3、ascorbic acid、cAMP、forskolin组成；35℃培养箱中静置培养14-20天，每3天换液；收获细胞后即得到多巴胺能神经元。

上述步骤1、2中细胞的无血清培养基的配方可以为DMEM/F12、B27(1∶50，即产品说明书建议比例)、N2(1∶50，即产品说明书建议比例)、bFGF(basic Fibroblast Growth Factor，碱性成纤维因子，20ng/mL，购于Lifetechnologies)与EGF(Epidermal Growth Factor，表皮生长因子，20ng/mL，购于Lifetechnologies)。