[发明专利]BHK-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及BHK-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用，属于兽用生物制药领域。 

背景技术

目前，国内禽用疫苗的生产主要依靠传统的“鸡胚法”(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典 三部 二〇一〇年版.中国农业出版社2011年)工艺实现。“鸡胚法”制取疫苗的技术由来已久，最初于20世纪50年代开发，虽然这种技术也不断进化来应对各种挑战，包括产量、自动化、容量、质量保证和生产速度等方面。但在我国，在实际的生产过程中，由于SPF(无特异性病原)鸡胚供应量的制约以及成本问题，许多的国产疫苗并非全部由SPF鸡胚制造。尤其是禽用弱毒疫苗的制备，若所用鸡胚来自普通鸡蛋，可造成外源病原的污染，并由此造成了某些疫病的传播和蔓延。与此同时，鸡胚中的母源抗体还会干扰接种疫苗病毒的繁殖，直接影响疫苗的质量，常常会造成免疫失败。 

悬浮BHK-21细胞已成功在口蹄疫疫苗生产中应用，不仅缩短了疫苗生产周期，降低劳动强度和生产成本，还减少批间差异提高了疫苗质量，悬浮BHK-21细胞在新城疫疫苗上的应用，有望终结新城疫疫苗的鸡胚时代。 

发明内容

本发明的目的是筛选和驯化一株适应BHK-21全悬浮细胞培养的新城疫病毒适应株用于鸡新城疫疫苗生产。 

本发明的技术方案 

(1)病毒株的选育 将新城疫病毒Mukteswar株经BHK-21细胞连续传代，获得的BHK-21细胞适应毒，命名为新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)Mukteswar株/BHK-21，该毒株已于2014年6月17日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.8889。 

(2)悬浮细胞株的驯化与选育 将适合新城疫病毒培养用BHK-21细胞进行全悬浮驯化和连续克隆纯化选育，获得全悬浮的幼金仓鼠肾细胞BHK-21/IVDC株，该细胞株已于2014年6月17日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.9319。 

(3)悬浮细胞扩大培养 复苏BHK-21/IVDC株悬浮细胞，采用悬浮细胞培养瓶逐级放大为5个500ml规格的悬浮培养瓶，待细胞浓度达到4×10⁶细胞/ml后，全部转移至美国NBS BioFlo 115型总体积14L的反应器，补加培养基至10L，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO₂，转速80r/min，温度37℃，pH 7.2，溶氧60％，分别于培养24h、48h采样进行细胞计数和活力检测。 

(4)接毒和收毒 当BioFlo 115型反应器中活细胞密度不低于2.5×10⁶细胞/ml时，按细胞培养液体积的1％比例接入新城疫病毒Mukteswar株/BHK-2，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO₂，转速80r/min，温度37℃，pH 7.4，溶氧60％，，于接毒后24h起，每隔2h采样进行细胞计数，活细胞密度低于0.5×10⁶后，收获病毒液即为抗原。 

2.用于制备抗原所述的病毒，可以是新城疫病毒的任何疫苗生产毒株。 

3.用以上所述的新城疫病毒抗原制备疫苗。 

4.用以上所述的新城疫病毒抗原制备疫苗的方法，包括：将Mukteswar株/BHK-21细胞毒在BHK-21/IVDC株细胞中大量增殖，加入冻干保护剂经真空冷冻干燥制备新城疫活疫苗。 

5.用以上所述的新城疫病毒抗原制备疫苗的方法，包括：将Mukteswar株/BHK-21细胞毒在BHK-21/IVDC株细胞中大量增殖、灭活，加入佐剂制备新城疫灭活疫苗。 

6.用于以上4或5所述的新城疫病毒抗原制备疫苗的方法，包括新城疫病毒的任何疫苗生产毒株。 

7.以上3所述的的新城疫疫苗在预防新城疫中的应用。 

本发明具体实施方式 

具体包括以下步骤 

1.病毒株的选育 

(1)将鸡胚培养增殖的新城疫疫苗生产种毒接种生长良好的细胞单层的BHK-21细胞，加入维持液培养，得到适应BHK-21细胞的新城疫病毒疫苗生产用毒种；