[发明专利]细胞穿透肽转染试剂及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种细胞穿透肽转染试剂及其应用。

背景技术

细胞膜是防止细胞外物质自由进入细胞的屏障，它保证了细胞内环境的相对稳定。也正是因为细胞膜的生物屏障作用阻止了许多生物大分子物质进入细胞内，从而很大程度地限制了这些物质在治疗领域的应用。因此，如何引导这些物质穿透细胞膜是一个迫切需要解决的问题。

介导生物大分子穿透细胞膜的方法主要包括细胞穿透肽(cell penetrating peptides，CPPs)、脂质体(liposome)、腺病毒(adenovirus)、纳米颗粒(nanoparticle)等。其中，细胞穿透肽是一类以非受体依赖，非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽，它富含碱性氨基酸，氨基酸序列通常带正电荷。细胞穿透肽的一个重要特点是可以携带多种不同大小和性质的生物活性物质进入细胞，包括小分子化合物、染料、核酸、质粒DNA、siRNA、多肽、蛋白质等。细胞穿透肽作为载体的优势在于低毒性和无细胞类型的限制，这一性质为其成为靶向药物的候选载体提供了可能。其实际应用多集中于各种大分子物质，包括siRNA和质粒DNA的细胞转运。

目前被广泛应用的细胞穿透肽包括TAT肽(HIV-1的TAT蛋白功能区)，穿膜肽(transportan)，寡聚精氨酸[poly(arginine)9,R9]，MPG(融合HIV-1 gp41的蛋白功能区和SV40T抗原的核定位序列)等，尽管细胞穿透肽本身可以快速和高效的进入细胞，但其实际应用中的主要问题在于如何优化设计细胞穿透肽，使其能有效的结合siRNA或质粒DNA，高效的进入细胞，快速摆脱内涵体或溶酶体导致的降解，将siRNA或质粒DNA传递到相应的细胞内的作用部位。然而，现有的细胞穿透肽转染试剂转染效率不高，因此如何获得高效的细 胞穿透肽转染试剂是本领域的技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

为了克服现有技术特缺陷，本发明提供一种新型的细胞穿透肽转染试剂及其应用。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明涉及一种细胞穿透肽转染试剂，其特征在于所述的细胞穿透肽转染试剂是由23个氨基酸组成的肽链，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的细胞穿透肽转染试剂是通过固相肽合成法获得的。

本发明另一方面还涉及所述的细胞穿透肽转染试剂核酸分子转染中的应用。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的转染在转染时无需进行培养基更换操作。

本发明的细胞穿透肽转染试剂不仅具备结构简单，高转染效率和细胞毒性小的特点，而且转染时无需进行培养基更换操作，尤其适合各种高通量细胞筛选实验，方便，快速，高效。该试剂的这些特点创造性地解决了高效输送各种核酸分子到达目的地的难题。

附图说明

图1：FITC萤光标记的细胞穿透肽广泛分布于细胞浆内呈绿色荧光。(B，20μgFAM-标记的细胞穿透肽与180μL细胞培养基混合后加入到A549细胞中；A.作为对照，相同量的PBS溶液与PBS混合后加入到A549细胞中，细胞核由DAPI染色后呈现蓝色。)

图2：细胞穿透肽介导的DY547萤光标记的siRNA广泛分布于细胞浆内呈红色荧光。B为细胞穿透肽与180μL细胞培养基混合后加入到A549细胞中。作为对照，相同量的PBS溶液与PBS混合后加入到A549细胞中，细胞浆中无红色荧光显现。细胞核由DAPI染色后呈现蓝色(A)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

实施例1：

多肽合成

多肽合成之后，在美国金斯特科技股份有限公司(Piscataway,NJ)利用高效液相色谱法进行纯化(纯度＞95％)。配制FAM(0.1mM)、二异丙基乙胺(0.5mM)和二氨基甲酰胺(DMF)混合液，将树脂固定的多肽(0.1mM)在混合液中孵育12h，使得荧光素集团(FAM)通过氨基乙酸标记在多肽的N端。在色谱柱C18中利用反相高效液相层析法对多肽混合物进行分析纯化后，将纯化的多肽利用电喷雾电离质谱法(ESI-MS)分析。

siRNAs合成

抗PPIB蛋白的DY547标记的siRNA由赛默飞世尔科技合成。DY547标记的对照siRNA购买自赛默飞世尔科技Dharmacon。

细胞穿透肽在A549细胞中的转运(图1)