[发明专利]一种同时检测人的Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型副流感病毒的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术应用领域，尤其是用于人的I型、II型及III型副流感病毒的同时检测与鉴定。

背景技术

人副流感病毒(Human parainfluenza viruses，HPIVs)属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)是一种能引起感冒并诱发气管炎、支气管炎和肺炎的主要病原体之一，人群普遍易感。副流感病毒粒子呈球形，有包膜，直径一般为150～250nm，基因组由不分节段的单股负链RNA组成，包含大约15000个碱基，编码至少6种常见的结构蛋白(3’-N-P-C-M-F-HN-L-5’)。人副流感病毒(HPIVs)可分以分为4个血清型(HPIV1-4)，HPIV-4根据抗原性的不同又被分成A和B两个亚型。HPIV-1和HPIV-3属于人鼻病毒属，而PIV2和PIV4属于腮腺炎病毒属。HPIV-1、HPIV-2和HPIV-3在婴幼儿、儿童和免疫缺陷人群中引起下呼吸道感染的主要病原体，同时又是青少年和成年人上呼吸道感染的病原体。特别是HPIV-1和HPIV-3是常常在公共场所引起呼吸道感染主要原因之一，而HPIV-4引起的感染一般症状比较轻微，临床上意义不大，很少引起呼吸道感染的暴发。所以本发明检测方法只针对HPIV1-3三个型别的鉴定。

人副流感病毒的HN基因编码的HN蛋白属于膜蛋白，主要功能是通过与细胞唾液酸受体的结合，促进病毒与宿主细胞的黏附，并且与病毒的释放有关。免疫学研究发现HN也是主要的保护性抗原之一，相应的抗体对病毒具有中和作用，因此HN成为临床检测以及疫苗研究的主要目标蛋白之一。

目前，国内外检测副流感病毒的经典方法是病毒的分离培养，但是其操作烦琐，耗费时间长；电镜、免疫组化、ELISA、常规PCR等具有各自突出的优点，但都很难检测微量核酸和准确定量，20世纪末发展起来的实时荧光定量PCR技术(Real-time fluorescent quantitative PCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，该技术不仅实现了对模板的定性和定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实验多重反应、自动化程度高、无污染性、具有实时性和准确性等特点。因而，在呼吸道病原体检测中具有巨大应用优势。相对普通PCR及单荧光PCR，多重荧光PCR具有以下优点：(1)检测效率高，即多重荧光PCR可以实现一管多检，通过收集的不同波长的荧光信号来区分不同的检测对象，从而简化操作流程；(2)节省试剂成本和人员操作时间，尤其在开展大量样品检测时，可以显著地降低检测成本和操作时间。(3)本方法中含内质控基因的监控，在各类标本中，存在各种影响或抑制PCR反应的因素，且在标本的采集处理、核酸提取、扩增和分析过程中，也可能因人为操作失误而导致产生假阴性检测结果。因此本申请采用内质控的方法，在标本中含有的内质控基因(LDHA)经历检测标本核酸提取、加样、PCR扩增及信号检测的全过程，从而可对每一份标本实施监控。

本发明成功建立的可同时检测人的I型、II型及III型副流感病毒一步法多重荧光RT-PCR方法，采用LDHA作为内质控，可以有效监控样本中的PCR抑制因素以及由操作误差所造成的假阴性结果。并且该方法除了具有特异性强、灵敏度高、检测效率高及稳定性的特点之外，其检测所需要RNA量较少，且操作简便快速，在副流感病毒的现场检测、卫生评价、临床诊断等方面显示出良好的应用前景。并有利于进一步深入研究相关病原体感染的分子机理和免疫调节机理、开展有效的临床治疗等方面显示出良好的应用前景。

发明内容

本发明是由国家“十二五”科技重大专项2012ZX10004206-002支持的。我们成功设计和合成了针对人的I型、II型及III型副流感病毒相应HN基因特异性引物和探针。基于此引物和探针，我们建立了一步法含内质控的多重荧光RT-PCR检测方法。该方法通过对多种相关病毒的检测、标准曲线的构建、与商品化单重荧光RT-PCR诊断试剂盒比较、重复性试验等，说明该方法具有较高的特异性、灵敏度、高效性和稳定性。

在本发明的第一方面，提供了一种针对人的I型、II型及III型副流感病毒HN基因的特异性引物和探针序列，如SEQ NO：1至12所示。

在本发明的第二方面，提供一种同时检测人的I型、II型及III型副流感病毒的试剂盒，该试剂盒中含有第一方面所述引物和探针。

在一个实施方案中，所述试剂盒包括以下成份：

a)反应缓冲液，所述缓冲液为常规PCR反应缓冲液；