[发明专利]一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法

权利要求书

1.一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

根据β-酪蛋白基因的碱基序列，在β-酪蛋白基因第67位氨基酸编码序列附近设计可以扩增产生TaqI酶切位点的引物，所述引物的序列为：

上游引物：5’CCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATCG3’；

下游引物：5’CATCAGTGAGAGTCAGGCTCTGCCT3’；

利用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增，扩增出的A1型β-酪蛋白基因片段内部会产生一个TaqI酶切位点；扩增出的A2型β-酪蛋白基因片段内部不会产生TaqI酶切位点，则无法被TaqI切开，仍为253bp的条带。

利用限制性内切酶TaqI对扩增产物进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断，含有A1型β-酪蛋白基因的扩增产物在酶切之后就会产生一个218bp的片段和一个35bp的小片段；含有A2型β-酪蛋白基因的扩增产物则无法被TaqI切开，仍为253bp的条带。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增具体包括如下操作：取DNA模板1ul，加入0.05～0.15U/ul的热启动TaqDNA聚合酶0.5～1.0ul、2～3uM的dNTP0.5～1.5ul、5～15uM的上、下游引物各0.5～1.5ul、2×PCRBuffer5～15ul、加双蒸水至15～35ul得PCR扩增体系，将所述扩增体系加热至92～95℃预变性5min，然后92～95℃变性15s、52～65℃退火25～35s、68～72℃延伸25～35s，自变性开始至延伸结束记为一次循环，进行30～45次循环后，在68～72℃再延伸4～10min。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述限制性内切酶TaqI的酶切包括如下操作：取PCR扩增产物5～13ul，加入限制性内切酶TaqI0.15～0.35ul，缓冲液0.5～1.5ul，加热至60～70℃孵育2～4h，升温至75～85℃热失活10～30min。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述DNA模板的浓度为45～55ng/ul，所述TaqDNA聚合酶的浓度为0.1U/ul，加量为0.5ul，上、下游引物的浓度为10uM，加量为1ul，所述2×PCRBuffer的加量为10ul，所述预变性温度为95℃，时间为2min，所述变性温度为95℃，时间为15s，所述退火温度为61℃，时间为30s，所述延伸温度为72℃，时间为30s，所述循环次数为35次，所述再延伸温度为72℃，时间为7min。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增产物的加量为9ul，所述限制性内切酶TaqI的加量为0.2ul，所述缓冲液的加量为1ul，所述孵育的温度为65℃，时间为3h，所述热失活的温度为80℃，时间为20min。