[发明专利]菊芋离体茎尖超低温保存及再生培养方法

说明书

本发明提供一种菊芋离体茎尖超低温保存及再生培养方法，包括以下步骤：材料获得、茎尖剥取、蔗糖预培养、装载液装载、PVS2玻璃化保护液脱水处理、超低温冷冻保存、解冻洗涤和恢复再生培养步骤。采用本发明的小滴玻璃化法超低温保存技术，超低温保存后的菊芋试管苗离体茎尖经过化冻处理，恢复培养后直接再生成苗。表明该方法是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存菊芋种质资源的方法，存活率可达90％以上，再生率可达80％以上，再生植株恢复生长良好。

技术领域

本发明涉及植物种质资源的超低温保存方法，，具体地说，涉及菊芋离体茎尖超低温保存及再生培养方法。

背景技术

菊芋(Helianthus tuberous L.)又名‘洋姜’、‘鬼子姜’，为菊科向日葵属多年生草本植物，因其地上似菊，地下似芋而得名。原产北美洲，在美国、加拿大、墨西哥等国均有广泛分布。17世纪经欧洲传入我国，目前分布在东北三省、内蒙古、北京、河北、河南、湖北、湖南、甘肃、青海、浙江、陕西、新疆、安徽、宁夏、江苏、山东、山西等省市。菊芋具有很强的抗逆性，生态适应性很广。菊芋为无性繁殖作物，其繁殖能力很强，地下块茎繁殖速度可达每年20倍以上。菊芋是一种不可多得的生态经济型植物，喜温暖、耐严寒、耐盐碱，具有很高的经济价值、药用价值、观赏价值和生态价值。菊芋在工业上应用广泛，利用其块茎转化成乙醇和生物燃料等生物能源，应用于化工、生物制药、航天等领域。菊芋块茎中含有丰富的菊粉，是理想的功能性食品配料，用作甜味增味剂，营养价值高。菊芋地上部分生物量很大，茎叶可直接用于家畜的青饲料，被联合国粮农组织称为“21世纪人畜共用作物”。菊芋可入药，性甘味凉，有清热解毒之功效，提取的菊糖对血糖具有双向调节的作用，对糖尿病的治疗具有很好的防治作用。菊芋含有的菊粉及低聚果糖还具有超强增殖人体双歧杆菌的作用。

菊芋种质资源目前主要采用非原生境保存中的田间圃位保存和试管苗保存。田间圃位保存时，易受环境的影响而导致种质消失。如地下块茎容易受到病毒的侵害，使病毒大量积累，导致品种退化，产量降低；另外，城市土地开发、环境恶化也严重威胁菊芋种质资源的安全保存。试管苗保存虽然具有占地面积小、不易受自然灾害和病原菌影响以及人力、财力投入少、便于种质资源交换及运输等优点，但需要经常继代更新，且经过多次继代培养后面临发生退化现象或产生变异等威胁。

超低温保存技术是可长期安全保存种质资源的可选择的较佳途径之一，不但节约空间，而且成本低廉。现已开发出多种超低温保存方法，然而针对不同物种甚至对于同一物种的不同品种，其适宜的超低温保存方法及程序技术都有可能不同。迄今为止，国际上尚未建立起具有普适性的超低温保存方法，这也是超低温保存技术实际应用中的主要瓶颈之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种菊芋离体茎尖超低温保存及再生培养方法。

为了实现本发明目的，本发明基于小滴玻璃化法超低温保存技术，提供的一种菊芋离体茎尖超低温保存及再生培养方法，包括以下步骤：材料获得、茎尖剥取、蔗糖预培养、装载液装载、PVS2玻璃化保护液脱水处理、超低温冷冻保存、解冻洗涤和恢复再生培养步骤。

材料获得具体步骤如下：

1)将菊芋块茎种植到花盆中，待其生长到35-45cm(优选40cm)，剪下生长健壮的枝条作为外植体，将其剪成2-3.5cm长(优选3cm)的带芽茎段，用水冲洗表面污渍，用10％NaClO溶液表面消毒8～9min(优选8min)，无菌水冲洗3～5次后，将外植体接种到MS+15g/L蔗糖+8g/L琼脂培养基中进行试管苗培养；

2)试管苗生长稳定后转入MS+0.1mg/L GA₃+15g/L蔗糖+8g/L琼脂培养基中进行试管苗扩繁培养；培养温度为20±1℃，光照14h/d，光照强度2000～3000lux。

茎尖剥取具体方法如下：经试管苗培养，选取生长4～5周的健康植株，在无菌条件下，剪取带顶芽的茎段，去除包裹在外面的大叶片，然后在显微镜下剥去小叶片，切取大小2～3mm，带2个叶原基的茎尖。