[发明专利]高GC含量大片段DNA的体外组装方法及应用

权利要求书

1.一种靶核酸序列的体外组装方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供用于拼接的n个结构单元，各结构单元的序列记为L_n，其中所述的n为2-6的正整数；和线性化的载体元件；

其中，

(i)所述的n个所述结构单元可拼接成式I所示结构的、两端分别带有第一和第二重叠区以及第一和第二限制性内切酶酶切位点的第一级拼接序列：

L1-L2-L3-…-Ln (I)

式中，

L1、L2、……、Ln为各结构单元的核苷酸序列；

并且，位于第一级拼接序列的5'端的L1具有从5'至3'方向的式II所示的结构：

X0-X1-X2-X3-L1' (II)

式中，

X0为无或任意的长度为1-100bp核苷酸序列；

X1为第一重叠区；

X2为第一限制性内切酶酶切位点，并且所述的第一限制性内切酶选自下组：NheI、NdeI；

X3为无或任意的长度为1-20bp核苷酸序列；

L1'为待保留的拼接单元序列；

其中，X0-X1-X2-X3构成位于5'端的第一侧翼序列；

并且，位于第一级拼接序列的3'端的Ln具有从5'至3'方向的式III所示的结构：

Ln'-X4-X5-X6-X7 (III)

式中，

X7为无或任意的长度为1-100bp核苷酸序列；

X6为第二重叠区；

X5为第二限制性内切酶酶切位点，所述的第二限制性内切酶选自下组：NheI、NdeI；并且所述的第一限制性内切酶和第二限制性内切酶是不同的酶；

X4为无或任意的长度为1-20bp核苷酸序列；

Ln'为待保留的拼接单元序列；

其中，X4-X5-X6-X7构成位于3'端的第二侧翼序列；

并且，第一重叠区和第二重叠区是互不相同的，且GC含量为0-50%；

(ii) 所述线性化的载体元件的结构如式IV所示，

X0b-X1b-X2b-X3b-Z-X4b-X5b-X6b-X7b (IV)

式中，

X0b为X0的互补序列；

X1b为X1的互补序列，即第一重叠区的互补序列；

X2b为所述的第二限制性内切酶酶切位点；

X3b为X3的互补序列；

Z为载体的结构序列；

X4b为X4的互补序列；

X5b为所述第一限制性内切酶酶切位点；

X6b为X6的互补序列，即第二重叠区的互补序列；

X7b为X7的互补序列；

(b) 在外切酶、聚合酶和/或连接酶酶存在下，使上述的n个结构单元和线性化的载体元件进行组装，从而形成式V所述的第一级连接产物，其中所述连接产物为环状；

(V)

式中，L1、L2、L3、Ln、X0b、X1b、X2b、X3b、Z、X4b、X5b、X6b、X7b的定义如上所述；

(c) 用所述的第一限制性内切酶和/或第二限制性内切酶对上一步骤的连接产物进行酶切，从而获得用于下一级组装的结构单元；并且重复步骤(a)和步骤(b)共j次，从而形成第j+1级连接产物，其中j为1-5的正整数，并且所述的靶核酸序列的CG含量≥65%，所述的第一重叠区的CG含量为0-50%，所述的第二重叠区的CG含量为0-50%。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，X0、X3、X4、和X7中的一个或多个为无。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，X0b、X3b、X4b、和X7b中的一个或多个为无。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一侧翼序列中的X1为SEQ ID NO.:1和/或所述的第二侧翼序列中的X6为SEQ ID NO.: 2。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的两个相邻的结构单元之间设有长度为10-50bp的粘性末端。