[发明专利]筛选抗分解代谢产物阻遏效应的产纤维素酶高效突变子的方法

说明书

技术领域

本发明属于菌种改良领域，具体地说是涉及一种通过菌种诱变获得抗分解代谢产物阻遏效应的突变子从而提高木霉、曲霉、青霉等真菌发酵产生纤维素酶活的方法。

技术背景

木霉属(Trichodermaspp.)、曲霉属(Aspergillusspp.)、青霉属(Penicillium spp.)等真菌由于具有较强的纤维素酶活力而被广泛的研究及应用，其中木霉属中的里氏木霉(Trichderma reesei)、曲霉中的黑曲霉（Aspergillus niger）及青霉属中的斜卧青霉（Penicillium decumbens）等菌株所分泌的纤维素酶具有产量高、种类相对齐全等特点，是工业生产纤维素酶的主要菌株。它们所能合成的纤维素酶包括外切-β-1,4-葡聚糖酶 (exo-β-1,4- glucanase)、内切-β-1,4- 葡聚糖酶 (endo-β-1,4-glucanase)和β- 葡萄糖苷酶(β-1,4- glucosedase)等三大类中的数十种，常见的有2种外切酶（CBHⅠ、CBHⅡ）、5种内切酶（EGⅠ、EGⅡ、EG Ⅲ、EGⅣ和EG Ⅴ）及2 个葡萄糖苷酶 (BGⅠ、BGⅡ)。

纤维素酶是诱导酶，其表达能力不仅与基因调控序列有关，而且同外源诱导物有关。纤维素酶的诱导物质主要是一些糖类，包括聚糖、寡糖和单糖等。其中以纤维素、槐糖的诱导效果最好，乳糖和纤维二糖的诱导效果次之，山梨糖不仅具有诱导作用，并且可以促进胞外蛋白的分泌。不同诱导剂的物理性质不同，如纤维素是不可溶性物质，而其他糖类为可溶物质，这也造成了不同诱导剂进入胞内的方式不同，进入胞内所激发的的诱导方式也不尽相同，这也造成了诱导体系的复杂性。

纤维素酶表达是功能基因表达、诱导物正向激活和分解代谢产物阻遏机制共同作用结果。引起分解代谢产物阻遏机制的常见物质有甘油和葡萄糖等容易利用碳源；在产酶真菌的发酵过程中，葡萄糖等物质的存在会严重抑制纤维素酶的合成，该过程中起主要作用的是CREⅠ（里氏木霉及斜卧木霉）或CRE A（黑曲霉）阻遏蛋白，高浓度的葡萄糖可显著增加cre1 mRNA或creＡmRNA的表达水平。CRE A对黑曲霉中的木聚糖酶基因及多种纤维素酶基因有较强的阻遏效应；而CREⅠ对里氏木霉中的9种纤维素酶基因及斜卧青霉中的6种主要纤维素酶基因均有阻遏效应；cre1（creＡ）基因缺陷性的菌种即使在含有葡萄糖的培养基中也能够产生纤维素酶，工业中应用极为广泛的里氏木霉Rut C-30就是cre1基因突变缺陷性菌株。

里氏木霉、黑曲霉及斜卧青霉等菌株的发酵碳源往往是难以利用的纤维素类物质，葡萄糖含量很低甚至没有，这虽然避免了分解代谢产物阻遏效应所造成的发酵酶活偏低的问题，但是由于纤维素类物质较难进入菌体生理代谢，从而导致发酵过程菌体生长缓慢，不仅延长了发酵时间，并且对总酶活的提升有严重影响。若能使菌株获得抗分解代谢产物阻遏效应，则可以在发酵产酶中通过在初始培养基中加入适量的葡萄糖等快速利用碳源从而使菌体大量快速生长，提高菌体总量并提前进入产酶状态；此外还可以通过发酵中途补加葡萄糖以期延长菌种的次生代谢阶段及产酶时间，从而获得活力更高的纤维素酶。

葡萄糖虽然对里氏木霉、黑曲霉、斜卧青霉等真菌的产酶过程具有阻遏效应，但是它可以被当碳源或能源物质被迅速消耗，从而削弱甚至解除分解代谢产物阻遏效应； 2-去氧基葡萄糖是葡萄糖的衍生物，该物质为非代谢型天然六碳糖，并不能作为碳源或能源物质被进入微生物生理代谢途径；与葡萄糖相同，2-去氧基葡萄糖同样对里氏木霉等产酶真菌同样具备分解代谢产物阻遏效应，能有效抑制里氏木霉等真菌产纤维素酶。由于以上特性，2-去氧基葡萄糖能对里氏木霉等真菌的产酶过程起到持续阻遏效应，利用这一性质可以在对里氏木霉等真菌进行菌种诱变后将2-去氧基葡萄糖作为底物加入到培养基中，从而为获得具有抗分解代谢产物阻遏效应的改良菌株提供了可能。

发明内容

本发明的目的是：提供一种筛选抗分解代谢产物阻遏效应的产纤维素酶高效突变子的方法，通过对木霉、曲霉及青霉属中的纤维素酶生产菌株进行菌种诱变，制备含有2-去氧基葡萄糖作为分解代谢产物阻遏物质，并以预处理水稻秸秆为单一碳源的筛选培养基和验证培养基，从而对诱变菌株进行筛选，进一步获得具有抗分解代谢产物阻遏效应的纤维素酶高效产酶突变菌株。