[发明专利]一种利用固定化皱褶假丝酵母细胞制备3-羟基丙酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及3-羟基丙酸的制备领域，具体涉及一种利用固定化皱褶假丝酵母细胞制备3-羟基丙酸的方法。 

背景技术

3-羟基丙酸(3-hp)是近年来兴起的一种重要的化学中间体，可以作为生产丙二酸、1，3-丙二醇、丁二酸，特种聚酯和丙烯酸的原料，还可以制备多种其它的重要精细化工产品，它是一种具有战略意义的重要生物基化合物，是解决资源能源危机的有效途径之一，特别是我国每年都有大量的农业废弃生物基资源没被开发利用，既浪费资源，又造成环境污染。 

目前国际上发达的国家已经实现了生物基转化3-hp的产业化，且作为生物基平台生产其它重要精细化工品，已被广泛应用于医药、生物材料、功能性材料、生物燃料和其它精细化工品等行业。在国际上，采用微生物转化和工程菌合成3-hp已成主流技术，然而我国利用微生物生产3-羟基丙酸产量始终较低，阻碍了产业化的进程，与国际先进的技术差距较大。 

细胞固定化技术是将细胞通过化学或物理的方法固定在水溶性或不溶性的颗粒状、管状、膜状的载体之上，能明显地提高细胞对酸碱度和热的稳定性。固定化生物细胞能持续增殖、休眠及衰亡，其活性始终保持稳定。细胞固定化技术在连续反应过程中一般不会流失，可用简便的方法回收再使用，可将生产变得连续化，其具有降低制作成本、节约能源消耗、简化环保方法等很多优点，使其在工业生产中被迅速推广普及。由于多数反应都是复合酶催化的，固定化细胞可以看作是固定化的复合酶，克服了固定化单酶催化单一反应的缺陷，同时解决了辅因子不可再生的问题。目前利用固定化细胞制备3-羟基丙酸的研究尚未见报道，有待于进一步研究。 

发明内容

解决的技术问题：为解决现有问题，本发明的目的在于提供一种利用固定化皱褶假丝酵母细胞制备3-羟基丙酸的方法，提高了3-羟基丙酸的产量，并降低了生产成本，适合产业化生产。 

技术方案：一种利用固定化皱褶假丝酵母细胞制备3-羟基丙酸的方法，包括以下步骤： 

（1）固定化皱褶假丝酵母细胞的制备：采用种子斜面培养基活化皱褶假丝酵母，经种子培养基和发酵培养基培养后获得皱褶假丝酵母液体发酵菌种，以皱褶假丝酵母液体发酵的菌种为固定化对象，采用固定化细胞技术，以海藻酸钠和氯化钙对皱褶假丝酵母进行包埋，形成固定化皱褶假丝酵母细胞；

（2）按照接种量为2-3个/ml的标准，将固定化皱褶假丝酵母细胞接种至发酵培养基中，20-40℃，150-250r/min摇床培养48-72h；

（3）待培养结束后，无菌纱布过滤分离固定化皱褶假丝酵母细胞和发酵培养基，再向固定化皱褶假丝酵母细胞中重新加入与步骤（2）等体积的新鲜发酵培养基，培养条件同步骤（2）；

（4）重复步骤（3）至固定化皱褶假丝酵母细胞完全破裂时终止培养；

（5）利用高效液相色谱测定每次过滤分离的发酵培养基中3-羟基丙酸含量。

所述固定化皱褶假丝酵母细胞的制备包括以下步骤： 

    第一步，采用种子斜面培养基28-32℃活化培养皱褶假丝酵母36-60h，用接种环剥离斜面上的菌落，用种子培养基培养，培养温度为28-32℃，培养时间为24-48h，再将种子培养基上的菌落制成菌悬液，接种到含有50-80ml发酵培养基的锥形瓶中，摇匀，28-32℃恒温150-250r/min振荡培养24-48h，获得皱褶假丝酵母液体发酵菌种；

   第二步，用无菌纱布过滤分离皱褶假丝酵母液体发酵菌种与发酵培养基，皱褶假丝酵母液体发酵菌种用去离子水清洗后，按照皱褶假丝酵母液体发酵菌种:海藻酸钠溶液为1:1-2:1（w/v）标准制备混合液，海藻酸钠终浓度在40-45g/L；

   第三步，用注射器吸取第二步所得混合液滴入CaCl₂溶液中形成直径为0.3-0.5cm固定化皱褶假丝酵母细胞，所述CaCl₂溶液的浓度为19-21g/L，室温固定1-3h后，4℃冰箱固定2-4h，再用去离子水冲洗2-4遍后4℃冷藏5-10d备用。

作为优选的是，步骤（2）的培养温度为30℃。 

作为优选的是，第二步的皱褶假丝酵母液体发酵菌种：海藻酸钠溶液质量体积比为1:1标准。 

作为优选的是，海藻酸钠终浓度为45g/L。 

作为优选的是，CaCl₂溶液的浓度为21g/L。 

有益效果