[发明专利]四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法

权利要求书

1.一种四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）二倍体矮牵牛减数分裂前期Ⅰ时花蕾大小的确定；

（2）当花蕾长度为2.5-3.0mm时进行2n雄配子诱导，得到的含有2n花粉的二倍体矮牵牛作为父本；其中父本2n花粉的染色体数为2x =14；

（3）有性多倍化杂交：以四倍体矮牵牛为母本，并对母本进行去雄处理，去雄处理后的母本与步骤（2）中的父本进行授粉杂交得到F₁；

（4）杂交后代F₁倍性的鉴定：第二年春季播种F₁种子，成株后进行农艺性状、解剖学鉴定，鉴定后选取配子染色体数目2x =14的植株即为通过有性多倍化途径获得的新四倍体种质。

2.根据权利要求1所述的四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法，其特征在于，步骤（1）中，于晴天上午8:00至10:00取二倍体矮牵牛幼小花蕾，测量其长度后用卡诺氏固定液固定24 h，经体积浓度为90%、体积浓度为80%乙醇梯度脱水最后转入体积浓度为70%乙醇4℃下保存备用；用l N盐酸60℃恒温水浴花蕾约2-3 min，蒸馏水冲洗3-4次，从花蕾中剥取花药，用质量浓度为1%醋酸洋红染色常规染色、压片，火焰拷片2s分色，在100倍油镜下对花粉母细胞减数分裂期进行观察，确定前期I时花蕾的长度；其中卡诺氏固定液是由无水乙醇与冰醋酸按体积比为3:1混合制得。

3.根据权利要求1所述的四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法，其特征在于，步骤（2）的操作方法为：采用秋水仙素溶液处理花蕾时间为早晨8:00-10:00，处理温度25℃-32℃，诱导二倍体矮牵牛产生2n花粉的秋水仙素溶液质量浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%，在二倍体矮牵牛花蕾（不包括萼片）为2.5-3.0 mm时进行处理，采用微量注射法，将注射器针头深入花蕾中注射9-11uL秋水仙素溶液，每天处理1次，分别进行1、2、3天处理，开花后套袋隔离，以未诱变处理二倍体植株为对照；然后取花粉粒于载玻片上质量浓度为1%醋酸洋红染色3min后，在40倍镜下用显微测微尺测量花粉的直径并结合外观特征确认2n花粉，统计2n花粉百分率，其中2n花粉百分率的计算公式为：

2n花粉百分率=2n花粉数/花粉总数×100%。

4.根据权利要求1或3所述的四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法，其特征在于，步骤（2）中得到的父本2n花粉形态特征为圆形或近似四边形，直径≧40um，有4个萌发孔，染色体数为 2x =14。

5.根据权利要求1所述的四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法，其特征在于，步骤（3）中所述的四倍体矮牵牛为‘红霞’。

6.根据权利要求1所述的四倍体矮牵牛的有性多倍化育种方法，其特征在于，步骤（4）中解剖学鉴定方法为：于晴天上午8:00-10:00取的植株上长度为2.6-5.8 mm幼小花蕾（不包括萼片），用卡诺氏固定液固定24 h后，经体积浓度为90%、体积浓度为80%乙醇梯度脱水最后转入体积浓度为70%乙醇4℃下保存备用；用l N盐酸60℃恒温水浴花蕾约2-3 min，蒸馏水冲洗3-4次，从花蕾中剥取花药，用质量浓度为1%醋酸洋红染色常规染色、压片，火焰拷片2s分色，在100倍油镜下对花粉母细胞减数分裂期染色体数目进行计数，选取配子染色体数目2x=14的杂交后代植株即为通过有性多倍化途径获得的新四倍体矮牵牛种质。