[发明专利]羊肝片吸虫的荧光定量PCR检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，尤其涉及羊肝片吸虫的荧光定量PCR检测试剂盒及应用，可以快速检测羊肝片吸虫感染。

背景技术

肝片吸虫病是由肝片吸虫（Fasciola hepatica）寄生于动物肝脏胆管中的一种人畜共患蠕虫病。此病呈世界性分布，常呈地方性流行，是我国分布最广泛，危害最严重的寄生虫病之一。肝片吸虫病可以引起人和动物的急性或慢性肝炎和胆管炎，并伴发全身性中毒现象，后期，终因恶病质而死亡。患畜食欲不振，营养不良，渐进性消瘦，生产力下降，病肝成为废弃物，给畜牧业造成巨大经济损失。人感染后食欲下降、呕吐、腹泻、消瘦、无力、气喘、贫血，有时颤抖、出汗等。患病动物是主要传染源，羊是最重要的终末宿主，也是主要传染源。调查显示，云南部分地区山羊、黄牛、水牛的感染率分别为25%、100%和80%，川西北牦牛和藏羊的感染率分别为23%和11%，四川绵阳市奶牛的感染率为17.8%，湖南牛肉感染率为2.35%。

目前通用的检测方法是粪便反复水洗沉淀法或尼龙筛兜集卵法后于显微镜下观察，该方法简便易行，但费时费力，敏感性较低，容易误判，ELISA方法容易造成假阳性和假阴性，而IHA法则操作繁琐，而且需要相应的设备与试剂，也不利于基层地区推广应用。因此，急需研究一种结果可信、简便快捷的诊断方法。荧光定量PCR检测方法反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰，比普通PCR更加灵敏便捷，并且无需电泳，节省时间。应用荧光定量PCR试剂盒检测羊肝片吸虫能够达到高通量、高效率的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种羊肝片吸虫的荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒由无菌去离子水、荧光定量PCR检测试剂、标准品、对照品。   

其中，荧光定量PCR检测试剂由SYBR Green Real-time PCR Master Mix、ddH₂O、检测用引物组成。

其中检测用引物为检测羊肝片吸虫的上游引物和下游引物共2条：

羊肝片吸虫上游引物（SEQ ID No：1）：5’-CAAAGTGACAGTGACGGAAC-3’，

羊肝片吸虫下游引物（SEQ ID No：2）：5’- CGTGGTTTAATAATCGGG-3’；

标准品为具有羊肝片吸虫（Fasciola hepatica）的重组质粒，其核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。

对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有羊肝片吸虫DNA片段的DNA样品，阴性对照为无羊肝片吸虫DNA的DNA样品。

本试剂与试剂盒保存于-20 ℃，尽量减少反复冻融。

本发明的另一个目的是提供所述的试剂盒在检测羊肝片吸虫这种食源性寄生虫中的应用。

本发明试剂盒使用方法：

每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品依次用无菌去离子水稀释为12.6ng/μl、1.26 ng/μl、1.26×10^-1 ng/μl、1.26×10^-2ng/μl、1.26×10^-3 ng/μl、1.26×10^-4 ng/μl。

1.  荧光定量PCR检测试剂的制备：总体积为24 μl。SYBR Green Real-time PCR Master Mix在冰上融化，在无菌操作台中依次加入SYBR Green Real-time PCR Master Mix 12.5 μl、ddH₂O 10.5 μl、上下引物各0.5μl，充分混匀，避光保存于-20℃，操作中避免直射光照射。

2. 荧光定量PCR反应管的制备：总体积为25 μl。荧光定量PCR检测试剂于冰上融化。在无菌操作台中依次取荧光定量PCR检测试剂24 μl，加入样本DNA（待检测样本、标准品、阳性对照品、阴性对照品）1 μl于PCR反应管中充分混合，每个样本均进行三次重复。操作中避免直射光照射。

2. 扩增检测：把荧光定量PCR反应管置于荧光定量PCR仪上，设置反应条件为：holding stage：95 ℃ 1min；Cycling stage：95℃ 10sec，57℃ 15sec，72℃ 35sec，共40个循环；Melt curve stage：95℃ 15sec，60℃ 1min，95℃ 30sec，60℃ 15sec。

3. 检测结果判定：当样本出现扩增曲线则判为阳性，当样本未出现扩增曲线则判为阴性。