[发明专利]人7型腺病毒的中和性单克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于单克隆抗体制备技术领域，具体涉及人7型腺病毒的中和性单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

应用表位肽免疫来制备单克隆抗体，特别是治疗性单克隆抗体，是很有吸引力的途径。表位肽代表着蛋白质抗原最小的免疫原性单位。因此表位肽免疫能使免疫反应精确定位，能很好的控制产生所需的免疫应答。然而，应用表位肽免疫来制备单克隆抗体通常阳性率很低。因为简单肽通常免疫原性差，不能呈现良好的空间构象，而且不能有效激活T细胞和免疫记忆细胞。正因为如此，很多改善表位肽免疫原性的方法被开发出来，例如联合合适佐剂应用、偶联脂肽应用、直接呈递至树突状细胞和应用微粒呈递系统。然而，由于应用的成分过于单一、未能从根本上改善抗原的免疫原性等原因，这些方法呈递或展示表位肽的效果差强人意，应用十分有限。

治疗性单克隆抗体是对抗感染性疾病的非常有希望的生物药物。我们知道，有些病毒不能在细胞系中培养或者在体外培养的产量很低。因此，用病原体颗粒免疫从而制备针对这些病原体的中和单抗十分困难。基于表位肽的免疫方法是解决这一问题的一个方法，但是很多病原体的中和表位是构象表位，而简单的肽和应用上述方法呈递或展示的肽均难以呈现出空间构象。因此，仍需要开发出更有效的表位呈递或展示系统，以增强免疫应答，提高感染性疾病中和性单克隆抗体制备的阳性率。

发明内容

为克服上述技术缺陷，本发明提供了一种人7型腺病毒中和性单克隆抗体及其制备方法和应用，该人3型腺病毒抗原表位展示载体系统能有效的展示外源表位，并增强免疫应答效应。

本发明目的之一是提供一种制备针对人7型腺病毒的中和性单克隆抗体的方法，所述方法包括如下步骤：

构建免疫原：将人3型腺病毒载体的六邻体第5高变区替换为所述人7型腺病毒的六邻体第5高变区基因，构建成嵌合病毒，将所述嵌合病毒作为所述免疫原。

所述人7型腺病毒的六邻体第5高变区的氨基酸序列如SEQ NO:1所示序列，所述氨基酸序列位于所述人7型腺病毒的六邻体的第255位到269位。

所述人3型腺病毒载体为E3区缺失并表达有增强型绿色荧光蛋白的人3型腺病毒载体。

所述人3型腺病毒载体的六邻体第5高变区的氨基酸序列如SEQ NO:2所示序列，所述氨基酸序列位于所述人3型腺病毒载体的六邻体的第264位到279位。

本发明的目的之二是提供了一种利用上述方法制备得到的鼠源的针对人7型腺病毒的中和性单克隆抗体。

本发明的目的之三是提供了一种分泌上述鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞株5MH5/3G5，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.C2014104。

本发明的目的之四是提供了一种利用上述方法制备得到的人源化的针对人7型腺病毒的中和性单克隆抗体抗体。

本发明的目的之五是提供了一种上述方法制备得到的针对人7型腺病毒的中和性人-鼠嵌合单克隆抗体。

本发明的目的之六是提供了一种药物组合物，包含上述人源化或人-鼠嵌合的单克隆抗体作为有效成分。

本发明将人7型腺病毒六邻体第5高变区(HAdv7HVR5)嵌入六邻体第5高变区缺失的人3型腺病毒载体，构建成嵌合病毒rAdMHE3；然后以嵌合病毒rAdMHE3为免疫原，免疫小鼠，利用杂交瘤技术，首次成功制备了针对7型腺病毒六邻体第5高变区(HAdv7HVR5)的HAdv7中和性单抗。本发明将外源中和表位嵌入3型腺病毒载体的高变区内，构建成展示外源中和表位的重组腺病毒，并以此为免疫原，制备针对外源表位的中和性单克隆抗体是可行的，能有效的展示外源中和表位，并增强免疫应答效应，对研制感染性疾病治疗性单克隆抗体具有重要意义。

附图说明

图1是荧光显微镜下观察3型腺病毒载体Ad3EGFP在HEp-2细胞中eGFP表达，图1A是pBRAd△E3GFP线性化片段转染HEp-2细胞后24小时(100×)的图像；图1B是重组腺病毒rAd_E3GFP感染HEp-2细胞后48小时(100×)的图像；

图2是嵌合体病毒构建示意图；

图3是嵌合体病毒的复制特性检测结果图；

图4是构建的嵌合病毒rAdH7R1、rAdH7R2、rAdH7R5(即rAdH7R3)和rAdH7R7(rAdH7R4)分别与3型腺病毒抗血清中和实验，检测中和滴度的实验结果图；

图5是用重组病毒rAdMHE3免疫小鼠后获得的抗血清在体外与7型腺病毒进行中和实验的结果图；