[发明专利]一种绵羊精原干细胞分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法

说明书

技术领域

本发明涉及家畜种质资源保存和优良品种繁育、组织器官再生等生物技术领域，具体涉及一种绵羊精原干细胞分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法。

背景技术

精原干细胞(SSCs)是最重要的成体干细胞之一。精原干细胞不仅有传宗接代的遗传功能，近来研究显示，精原干细胞很容易通过退分化产生多能干细胞，这使得精原干细胞操作技术得到生命科学、农业科学和医学各路专家的垂青。自从精原干细胞移植技术建立以来，精原干细胞的研究开始加速，2000年后，建立了小鼠和大鼠精原干细胞的体外长期培养方法，精原干细胞基础研究和应用研究都得到了迅速的发展。一方面，培养的精原干细胞经过遗传修饰再移植到受体睾丸，通过精子发生过程产生转基因的精子，进而繁殖出转基因动物。另一方面，培养的精原干细胞通过退分化产生生殖多能干细胞，用于再生医学研究，将能够应用于损伤的组织器官的再生修复。因此精原干细胞在生殖生物学研究、转基因动物技术研究、退分化诱导产生多能干细胞研究、动物种质资源保存研究及组织器官康复临床医疗研究上具有重要意义。

在遗传育种领域，父系的遗传性状是通过精原干细胞分化产生的精子通过受精传给后代的。以前绵羊繁殖及绵羊品种改良的体外研究(或称试管研究)集中在卵母细胞上。随着近十多年来对精原干细胞研究的进展，绵羊精原干细胞增殖和分化研究在绵羊繁殖及绵羊品种改良研究中的作用和意义越来越明显。通过精原干细胞移植将为绵羊杂种遗传优势的利用提供新的技术路线。因为杂交育种技术的实际应用往往存在一些实际困难，比如必须首先形成和保留大量的各自独立的种群(品种或品系)，这需要大量的工作和成本，但如果采用优良性状突出的公绵羊的精原干细胞做为品种资源，那么就把问题简化了。只要用这头公绵羊睾丸制备精原干细胞，进行增殖并冷冻保存，这就是一个很好的绵羊品种。需要时就将它复苏培养，再对受体公绵羊进行精原干细胞移植，就会产生出我们需要的优良绵羊的精子。只要保留优良公绵羊的精原干细胞，就保留了一个优良的绵羊品种，省去了耗时费力的保留大量种群的工作。另外，杂交育种工作的另一个难题是，本地品种和外来优良品种之间的自然条件或饲养条件相差很大，难以进行杂交育种，但是如果在本地绵羊品种中制备受体，用外来优良品种制备精原干细胞，然后将外来优良绵羊品种的精原干细胞注入本地绵羊受体睾丸，由本地受体公绵羊产生出外来优良品种的精子，用于与本地品种母绵羊进行杂交，预期能获得性状优良的绵羊杂种后代。

但是，绵羊精原干细胞的分离纯化和长期培养至今仍然是世界难题。精原干细胞研究最著名的专家Brinster带领的研究组2008年曾经发表论文说过大动物精原干细胞长期培养方法的建立还需要5至10年的研究。虽然鼠类的精原干细胞长期培养方法已经建立，由于种族差别、基因库差别、市售抗体不能通用等多种因素的存在，绵羊精原干细胞的长期培养方法不能照搬鼠类的方法。鉴于绵羊精原干细胞长期培养技术意义重大，不仅具有理论价值，在农牧业和医学上还具有经济应用价值和社会价值，美、欧、日、澳、韩等国均有科研组织致力于绵羊精原干细胞长期培养的研究，曾有绵羊精原干细胞的纯化、鉴定方面的报道，但是也存在分离纯化技术复杂，分离到的精原干细胞少，纯度不高的问题，特别是整套的绵羊精原干细胞分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的技术操作体系还没有成功的报道。

另外，目前的精原干细胞分离纯化方法主要有：隐睾手术富集法、酶解法、Percoll密度梯度离心法、流式细胞术分选法、免疫磁珠分选法、差异贴壁法等方法等。流式细胞术分选法和免疫磁珠分选法在鼠类精原干细胞中应用效果较好，但是两种方法都需要有与所研究物种的精原干细胞表面抗原特异性很好结合的抗体，而目前适用于绵羊精原干细胞的抗体并不常见，因此在绵羊精原干细胞的研究中并不适于使用流式细胞术分选法和免疫磁珠分选法。而隐睾手术富集法和Percoll密度梯度离心法都不能得到高纯度的精原干细胞，而且在实践中发现Percoll密度梯度离心法对精原干细胞的活力有影响，至今为止在成功的精原干细胞培养技术中还没有采用这两种方法的报道。