[发明专利]一种人免疫球蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）血浆采集：收集具有高效价的原料血浆；

（2）组分分离：将上述原料血浆用0.14mol/L氯化钠溶液稀释，并用醋酸缓冲液调pH为7.10±0.04，降温至0℃开始喷入冷乙醇，使最终乙醇浓度达到12%(v/v)，控制温度在-2.5±0.5℃，用醋酸缓冲液调pH为7.10±0.04，搅拌2小时，加入硅藻土，压滤分离出上清液A；

（3）沉淀压滤：向上述上清液A中继续喷入冷乙醇，使最终乙醇浓度达到20%(v/v)，控制温度在-5.0±0.5℃，用醋酸缓冲液调pH为6.80±0.04，搅拌2小时，静置两小时，加入硅藻土，压滤分离，收集沉淀物B；

（4）沉淀溶解：每Kg沉淀用9L 0.01mol/L氯化钠溶液将沉淀物B溶解后，加醋酸缓冲液调pH为5.00±0.04，喷入冷乙醇至最终乙醇浓度为17%，控制温度在-4.5~-5.5℃，搅拌2小时，静置6小时以上，对反应液进行压滤分离，收集压滤液C，冷却至-3~-5℃；

（5）超滤浓缩：用0.5mol/L盐酸溶液调压滤液C pH为3.8~4.0，使用5倍体积的注射用水进行透析，透析至乙醇含量＜1%，浓缩至蛋白浓度＞3%，收集蛋白浓缩液D；

（6）层析提纯：用醋酸缓冲液调蛋白浓缩液D pH为4.00~4.50，然后用磷酸-NaOH缓冲液调节电导率为0.15~0.17s/m，然后将蛋白液上预先用磷酸-NaOH缓冲液平衡好的Macrocap-Q离子交换柱进行层析提纯，收集层析蛋白液E；

（7）透析浓缩：向层析蛋白液E中边搅拌边缓慢加入0.5mol/L盐酸液，调节pH至3.80~4.00，用6倍体积的注射用水透析，透析至乙醇含量＜0.025%，将蛋白液浓缩至6%以上浓度，收集蛋白浓缩液F；

（8）S/D灭活：将蛋白浓缩液F用1μm滤板于室温中进行过滤，之后加入磷酸三丁脂(TNBP)和吐温-80，使得最终浓度为0.3%TNBP和1%吐温-80，进行S/D灭活；

（9）吸附纯化：收集灭活混合液G，上预先用平衡液平衡好的DEAE-纤维素柱，进行洗涤液洗涤10次，洗脱液洗脱3次，用0.45~1.0um滤芯的澄清过滤器过滤蛋白洗脱液，收集过滤后的蛋白过滤液H；

（10）超滤浓缩：将蛋白过滤液H用5倍体积的注射用水进行透析，将蛋白液浓缩至10%以上浓度，收集蛋白浓缩液I；

（11）半成品配置；

（12）DV50纳米膜除病毒；

（13）分装：将上步收集的蛋白液用1M碳酸氢钠溶液调整pH至6.4~7.4分装。

2. 根据权利要求书1所述的一种人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：所述的醋酸缓冲溶液的pH为4.0，冷乙醇是-15℃以下的95%的乙醇。

3.根据权利要求书1所述的一种人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：所述的硅藻土的加量(Kg)=25×V反应液(L)/1000。

4.根据权利要求书1所述的一种人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：所述的压滤时的压力控制在≤0.1MPa，超滤时用的注射用水的温度控制在2-8℃。

5.根据权利要求书1所述的一种人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（6）层析提纯步骤中的磷酸-NaOH缓冲液是由1mol/L的磷酸溶液与1mol/L的NaOH溶液配制而成的。

6.根据权利要求书1所述的一种人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（8） S/D灭活步骤的温度控制在24.0±1.0℃，同时缓慢搅拌6小时以上。

7.根据权利要求书1所述的一种人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于步骤（9）吸附纯化步骤的具体操作是：①平衡：将平衡液加入凝胶柱中，平衡液为0.16mol/L的NaCl；②洗涤：通过将洗涤液加入凝胶中来洗掉凝胶中的S/D灭活混合液和部分杂蛋白，洗涤液为0.21mol/L NaCl；④洗脱：通过将洗脱液加入凝胶中来洗脱凝胶上吸附的蛋白，洗脱液为0.28mol/L NaCl。

8.根据权利要求书1所述的一种人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于该制备方法可以用来制备乙型肝炎人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、破伤风人免疫球蛋白。