[发明专利]H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR引物、探针及其检测试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测领域，涉及一种H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR引物、探针及其检测试剂盒和检测方法。 

背景技术

禽流感是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)引起的禽类急性传染病，其发病率和死亡率极高，是危害禽类的主要烈性传染病之一，世界动物卫生组织(OIE)将所有高致病性禽流感列为法定通报性疾病，部分低致病性禽流感也属于法定通报性疾病，OIE成员一旦发现或怀疑发生通报性疾病时应立即向OIE中央局报告，并由OIE中央局向所有成员通报。禽流感病毒属于正粘病毒科A型流感病毒属，为单股负链RNA，多形态的有囊膜病毒，根据A型流感病毒的血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)表面抗原的不同，可进行亚型分类。目前已知A型流感病毒有16种HA亚型(H1～H16)和9种NA亚型(N1～N9)。 

2013年，中国在全世界范围内首次爆发H7N9亚型禽流感病毒感染人类疫情，这表明禽流感病毒已突破种间屏障，感染人类致病，甚至死亡。流行病学调查结果显示，虽然人感染H7N9亚型禽流感病毒后死率较高，H7N9亚型禽流感病毒引起急性呼吸道传染病，并已致多人死亡，但目前还没有相应的保护性疫苗可供使用。为了应对H7N9亚型禽流感疫情，提高对H7N9亚型禽流感疫情的防控能力，疾病防控机构迫切需要快速、有效的H7N9亚型禽流感病毒检测方法，因此建立快速、敏感、准确的H7N9亚型禽流感病毒检测方法具有十分重要和紧迫的意义。 

近年来，实时荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)技术在病毒检测领域得到了广泛的应用，它将普通RT-PCR技术与荧光定量检测技术相结合，不仅具有敏感性高、特异性强、重复性好等优点，而且通过分析软件对数据进行分析整理，结果更为准确直观，整个检测过程不需要打开试管，有效地减少了假阳性发生的机会，已成为病原体检测的重要方法。 

文献检索表明，目前国内外诊断H7N9亚型禽流感病毒的方法仍然是病毒分离、血清学试验和普通RT-PCR、单重荧光RT-PCR等，一次试验完成禽流感病毒H7亚型和N9亚型初步确认的双重荧光RT-PCR检测技术尚属空白。经典的病毒分离、血清学诊断方法费时费力， 不适于临床检测，不符合生物安全条例的要求，无法满足快速检测的要求。普通PCR不仅无法对病料样本中的病毒进行定量检测，且扩增反应后需要电泳检测，不仅不适于大批量样本的筛选，而且容易因操作污染造成假阳性。单重荧光RT-PCR，仅能对禽流感H7亚型或N9亚型进行检测。 

发明内容

为了解决上述技术难题，本发明通过大量实验研究筛选出高灵敏和高特异性的引物序列和检测探针，及特定的双重荧光RT-PCR反应程序和条件，针对2013年我国爆发H7N9亚型禽流感病毒变异株，构建了高敏感、高特异性的H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测试剂盒及检测方法，发明H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法及试剂盒，一次实验即可检测H7亚型和N9亚型禽流感病毒，具有快速、敏感性高、特异性强、重复性好等优点。 

本发明的目的在于提供一种H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测试剂盒。 

本发明的另一目的在于提供一种H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法。 

本发明所采取的技术方案是： 

H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR引物，其序列为： 

HA-F：5’-TGATGACTGTATGGCCAGTATTAGAAA-3’(SEQ ID NO：1)， 

HA-R：5’-TTGCATTGCCTCTTCCCTGTA-3’(SEQ ID NO：2)， 

NA-F：5’-AATCAGAGGGAAACACTCAAACG-3’(SEQ ID NO：3)， 

NA-R：5’-GCTTATCAGGGCGCGATACT-3’(SEQ ID NO：4)； 

或者为该些序列的核苷酸互补序列。 

一种H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。 

进一步的，上述试剂盒还含有RT-PCR检测探针，其序列如下所示： 

HA-P：5’-AACACCTATGATCACAGCAA-3’(SEQ ID NO：5)，