[发明专利]一种具有唾液酸水解酶活性的蛋白质及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一种具有唾液酸水解酶活性的蛋白质及其应用。

背景技术

单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)被证明具有显著的神经修护及再生活性，是神经退行性疾病或神经损伤的良好的治疗药物，目前已被应用于阿尔茨海默症、帕金森症等疾病的治疗中。由于生产技术的制约，GM1的价格非常昂贵，而在神经系统疾病中，GM1用药周期较长，一个疗程最少也要三个月，如此一来，治疗费用大幅增加，导致GM1普遍应用受到限制。

目前，GM1的生产主要是从动物脑组织，如猪脑、牛脑中进行提取。提取时用到大量的氯仿、甲醇等有机试剂，造成了环境污染。此外，由于猪脑组织的神经节苷脂(gangliosides，GLS)中，GM1的含量较低，仅为10-20％，大部分是多唾液酸神经节苷脂，如GD1a、GD1b、GD3和GT1b等。直接提取时大部分的多唾液酸神经节苷脂被当作废弃物丢弃掉，最后提取得到的GM1还不到神经节苷脂总脂的10％，一方面造成了猪脑原材料的浪费，另一方面也增加了成本。

猪脑中多唾液酸神经节苷脂GD1a、GD1b和GT1b的含量占总神经节苷脂的50-60％。对比各种神经节苷脂的结构可知，GM1可通过水解GD1a，GD1b和GT1b的唾液酸残基得到。以往，有研究者通过部分酸水解猪脑神经节苷脂(gangliosides，GLS)来制备GM1。但酸水解的稳定性差，不同批次之间质量不稳定。此外，酸水解的专一性差，容易产生副产物，造成了GM1产率偏低，且后续的产品分离纯化比较困难。也有研究者利用GLS作为诱导剂，与唾液酸水解酶产生细菌共同培养，通过这些细菌分泌的唾液酸水解酶来生物转化GLS，制备GM1。生物转化与酸水解相比，具有条件温和、专一性好等优越性。但是由于细菌分泌的唾液酸水解酶一般是诱导酶，即使用GLS进行诱导，分泌的唾液酸水解酶的量也非常少，造成了这一生物转化过程的效率很低，这一生产过程不适合放大，不适用于工业规模的应用。此外，细菌菌种容易出现退化、变异等问题，给生产过程增添了不稳定性。现在急需通过基因工程的手段，直接克隆和表达所需要的酶的基因，实现GM1的稳定制备。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有唾液酸水解酶活性的蛋白质及其编码基因与相关生物材料。该蛋白质不但具有较高的唾液酸水解酶活性，而且能将GLS转化为GM1。

本发明所提供的蛋白质，名称为Cce sia-1，来源于纤维菌(Cellulosimicrobium sp.)21，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；

b)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；

c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白质；

d)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白质。

其中，SEQ ID No.2由703个氨基酸残基组成，是天然唾液酸水解酶Cce sia-1(名称为N Cce sia-1)的氨基酸序列；SEQ ID No.4由724个氨基酸残基组成，是重组唾液酸水解酶Cce sia-1(名称为R Cce sia-1)的氨基酸序列；SEQ ID No.4是在SEQ ID No.2的氨基末端添加氨基酸序列：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的氨基酸序列。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上SEQ ID No.1所示的信号肽的编码序列得到。上述d)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述d)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上SEQ ID No.3所示的His-Tag的编码序列得到。

与Cce sia-1相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的与Cce sia-1相关的生物材料，为下述B1)至B16)中的任一种：