[发明专利]一种早期旱胁迫诱导高羊茅滞绿基因SGR基因的筛选试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高羊茅SGR候选基因的筛选试剂盒及方法。

背景技术

滞绿(stay green)是指植物在衰老过程中叶绿素不降解或降解不明显的现象，其最显著的特征是植株生育末期叶片保持绿色的时间较长，甚至完全不黄化。SGR基因在高等绿色植物中相继被克隆出来。早期研究主要是通过经典定位法，即遗传分析后，通过定位的染色体区域测序进行基因鉴定，再通过突变体互补验证。这些新发现的SGR基因主要由核基因编码并受衰老特异诱导表达，大多数来源于C型滞绿突变体，C型滞绿突变体的叶绿素降解功能因为遗传变异而异常，其叶绿素含量可以长期维持不变，但是，在生理功能退化方面与野生型无异，如拟南芥的突变体nye-1，水稻的突变体sgr和nyc3，辣椒(Capsicum annuum)的突变体cl，豌豆(Pisum sativum)的突变体JI2775，番茄(Solanum lycopersicon)的突变体gf，柑橘(Citrus sinensis)的突变体nan，蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的突变体sgr等。

已知的SGR蛋白结构中不包含任何已知的结构域，因此尚无法判断SGR可能的作用途径。不过可以明确的是，与水溶性叶绿素结合蛋白相比，SGR无法结合叶绿素，因此，SGR不是参与叶绿素代谢过程的酶。Park等通过研究水稻的sgr(stay green)突变体发现了OsSGR基因，并且发现该突变体中Psll捕光-叶绿素(LHCⅡ-Chl)复合体有积累效应，推测SGR基因作用于LHC II，是调控LHC II复合体稳定性的关键因子。在植物发生衰老时，位于叶绿体的SGR结合并形成SGR-LHC II复合体从而将LHCII-Chl复合体结构拆分，其他参与到叶绿体代谢途径中的分解蛋白酶便能够找到并结合到相应的亚基上进行下一步的降解活动。因此，就目前的研究推测，LHC II-Chl复合体的解离是叶绿素降解途径的前提，而SGR可能是参与LHCⅡ-Chl拆卸的候选蛋白质。

高羊茅(Festuca arundinacea)是禾本科羊茅属多年生草本植物，是我国目前使用量增长最快的草种，在我国广泛栽培，是南方地区绿期最长的冷季型草坪。冷剂型草坪草在夏季的“休眠”现象是生产利用中的主要限制因素。人们在草坪草种选择时更倾向于绿期长的草种。SGR突变体虽然不能延长植物的光合作用，但表型变化可以满足人们对绿色期延长的追求，所以延长绿色期是所有草坪草选育的主要目标之一。目前仅有研究报道1个高羊茅滞绿基因SGR候选基因senescence-inducible chloroplast non-yellowing protein1(GenBank:ADV57294.1)，高羊茅SGR的分子基础和调节机制相关信息匮乏。

随着高通量测序技术的迅猛发展，转录组分析方法已经从微阵列技术，SAGE及MPSS技术的低通量模式改变成RNA-seq的高通量模式。RNA-Seq(RNA序列分析技术即全转录组测序)，具有明显的优势，仅需要较少的RNA样品，就可对某个物种或者特定细胞类型的整体转录活动进行检测，更精确的揭示序列变化、基因表达的完整注释、基因在样品间的差异表达分析和检测可变剪接等，使整个转录组以高通量和定量的方式加以调查。这些独特的优势，使得RNA-Seq技术成为目前深入研究生物体转录组复杂性的强大工具，也被认为是一种发现新基因的有效手段之一。

数字基因表达谱(Digital Gene Expression Profiling，DGE)是利用高通量测序，系统、快速地检测某一物种特定组织在特定状态下的基因表达情况的技术。DGE已被广泛应用于基础科学研究领域。已有研究报道利用DGE对黄肉猕猴桃果实着色过程中相关差异基因、脂多糖活化巨噬细胞的基因表达、茎瘤芥根和茎组织转录组比较和小尾寒羊高繁性状相关基因的筛选和解析研究。

本地Blast(Local Basic Local Alignment Search Tool)是在本地化的蛋白质或DNA数据库中进行相似性序列比较的工具，已经被用于某一物种特定组织中某一个或家族的基因筛选。已有研究报道利用拟南芥WRKY转录因子家族基因序列为探针，对苹果全基因组序列执行本地Blast搜索，结合生物信息学方法来筛选苹果WRKY转录因子家族基因；以拟南芥和水稻ANK家族基因序列执行本地Blast搜索‘金冠’苹果全基因组序列，结合结构域搜索工具CD(conserved donmain)、perl程序等生物信息学方法，解析苹果锚蛋白基因ANK家族基因。

发明内容