[发明专利]猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测用引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测用引物及检测试剂盒。

背景技术

猪的附红细胞体病主要引起仔猪发热、贫血苍白、黄疸和母猪流产等症状，常与其他猪病混合感染危害严重，防治十分困难。近年来研究表明感染猪的附红细胞体的种类有两种，猪附红细胞体(Mycoplasma suis MS)和小附红细胞体(Mycoplasma parvum MP)，原来归于立克兹氏体目质体科，近年来根据16Sr RNA基因的序列分析和电镜的观察结果，将附红细胞体划分到支原体属的嗜血支原体。我们在附红细胞体感染的猪体内分离到第三种感染猪的新附红细胞体病原，并在Genbank上公布了其16S rRNA和rnpB基因序列(登录号JX489600和JX489603)，暂定名为未定种附红细胞体(Candidate mycoplasma haemosuis CMH)。由于嗜血支原体都不能够纯培养，对其研究造成很大的困难。目前临床上主要依靠显微镜检查鲜血压片和姬姆萨染色片进行诊断，这些方法存在滞后性和显著的假阳性，实验室诊断方法有检测抗体的酶联免疫吸附法(ELISA)和检测病原的聚合酶链式反应(PCR)诊断方法，但现有的诊断方法主要针对的病原为猪附红细胞体MS，对其他两种病原体MP和CMH的诊断方法尚未有报道。同时根据我们的临床调查发现，在我国浙江上海安徽等地区感染猪的附红细胞体种类主要为MP而并非国内外研究较多的MS。为了能够明确这类病原的致病性和致病机理，亟需可以诊断三种病原的诊断方法。

本发明首次将PCR技术应用于同时检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测领域，提供了针对猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测的特异性引物、试剂盒和检测方法。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的同时检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的核苷酸序列。

本发明要解决的第二个技术问题是提供快速、准确、使用方便的同时检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测引物，具体如下：

通过序列比较分析，根据猪附红细胞体ZJ NB01株16Sr RNA基因序列(GenBank登录号：KC907396)保守区199-582位置和小附红细胞体ZJ JX9330株16Sr RNA基因序列(GenBank登录号：HQ489599)保守区198-581位置设计一对通用引物：

1)MP和MS正义引物(MF)

5'TAAATTAAAGGAGGCTGCCGMAAGGTG3'(SEQ ID NO：1)；

2)MP和MS反义引物(MR)

5'TACGCCCAATAAATCCGGATAATGCTC3'(SEQ ID NO：2)；

其中，M代表兼并碱基A或C；

扩增目的片段为384bp，扩增到MS序列如序列表SEQ ID NO：5所示；

其中，21bp处M代表兼并碱基A或C。

扩增到MP序列如序列表SEQ ID NO：6所示；

通过序列比较，根据未定种附红细胞体CMH已公布的ZJ SXSY1102株16Sr RNA基因序列(GenBank：JX489600)，在其保守区441-972位置设计一对引物：

3)CMH正义引物(CMHF)

5’AAACTCTGATGGTACCTCCTGAATAAGTGA3’(SEQ ID NO：3)；

4)CMH反义引物(CMHR)

5’CCTTCGCTGGGGATGTCAAACCT3’(SEQ ID NO：4)；

扩增目的基因大小为532bp，序列如序列表SEQ ID NO：7所示；

其中，490bp处M代表兼并碱基A或C。

本发明还提供了一种猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒，由以下组分组成：

1)DNA提取试剂；通常可以使用商业购买的血液DNA提取试剂盒，例如杭州新景生物技术开发有限公司的全血DNA提取试剂盒(Blood DNA Mini kit，Cat.No.3001050)；

2)DNA标准品：含猪附红细胞体靶基因的T载体质粒和含未定种附红细胞体靶基因的T载体质粒；