[发明专利]制备抗人R47H-TREM2突变体的人单克隆抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种制备抗人R47H-TREM2突变体的人单克隆抗体的方法。

背景技术

阿尔茨海默氏病AD(Alzheimer’sdisease)是一种病因未明的原发性退行性脑变性疾病，该病患病率在老年人群中呈指数上升，65岁时患病率约为1％，至95岁时达到40％-50％，诊断AD后平均生存期为6-8年。据阿尔茨海默病(AD)国际联盟组织相关流行病学研究资料和世界卫生组织(WHO)提供的阿尔茨海默病患病率资料，目前全球有约2430万AD患者，预计每年新增阿尔茨海默病病例460万，且每隔20年将增加1倍。到2040年全球的AD及老年痴呆病例将达8110万。阿尔茨海默氏病(AD)的发病机制被认为是脑部的炎症。

目前对阿尔茨海默氏病AD的检查诊断主要有：1.通过AD患者的认知能力；2.根据病史及精神检查，3.家族AD遗传背景检查；4.影像学检查，如CT、核磁共振MRI等；5.Beta淀粉样蛋白的血液检查。

在现有的研究和实践中，生产人的单克隆抗体一直是非常困难的，这是由于用目的抗原来免疫人类是不切实际的。所以多数已产生的人的抗体一直是以外来可用的脾脏存在为基础的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对阿尔茨海默氏病(AD)患者具有重要的早期临床诊断和治疗潜力的制备抗人R47H-TREM2突变体的人单克隆抗体的方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：制备抗人R47H-TREM2突变体的人单克隆抗体的方法，包括步骤：

1)多肽抗原的合成

人工合成201条6～15aaR47H-TREM2多肽，使抗原决定族围绕TREM2基因突变靶点，并以TREM2的R47为中心向两边扩展，每条多肽序列错开1～2个aa；然后HPLCC-18反向柱纯化并冷冻干燥；

2)制备R47H-TREM2突变体多肽抗原阵列PeptideArray

使用96或184孔ELISA板，用包被缓冲液0.05mol/L碳酸盐缓冲液，将多肽抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜，次日洗涤3次并用湿盒4C保存；

3)CD22+B细胞的采集

收集60-80岁健康老年人和AD患者外周血，15mL/人，并用FicollHypaque试剂Sigma进行密度梯度离心以分离单核细胞Peripheralbloodmononuclearcells，然后用PE-Cy5-labelledanti-CD22抗体标记细胞并用流式细胞仪FACS(BDBiosciences)进行细胞分类，筛选出IgG+CD22+的B细胞；

4)细胞培养

在U-形底的96孔细胞培养板中，用RPMI1640培养基LifeTechnologies培养筛选出的IgG+CD22+B细胞，50cells/well；

5)B细胞永生化

细胞培养两周内加放射性(83Gy)照射过的自体来源的滋养细胞1x10⁵/well，30％体积的EB病毒培养液及1ug/ml的HL多肽，再用1ug/ml的HL多肽加50U/mlIL-2重复刺激7天，继续培养到28天后，收集各孔上清并用斑点印迹法(DotBlotting)检测、挑选产生抗人R47H-TREM2突变体的B-细胞阳性克隆；

6)用R47H-TREM2突变体多肽抗原列阵筛选B-细胞阳性单克隆。

作为优选的技术方案，所述HPLCC-18反向柱纯化，色谱柱型号为BakerBond10*250mm*5uM；柱温为30C；流速为1mL/min；流动项为乙腈/水5～95％梯度；检测波长为220nm。

用CD22抗体来识别、筛选本发明想要的B细胞，因为只有能被CD22抗体识别的B细胞才能表达本发明想要的anti-TREM2抗体。

本发明所涉及的抗原是“多肽”，固为多肽抗原阵列，英文名称为：Peptidearray或Peptidemicroarray。多肽抗原阵列是将不同序列的多肽片段的集合在固体表面上展示，在生物学，医学和药理学研究中，常用于蛋白质与蛋白质的相互作用及结合特性和功能的研究。在本发明中用它来找出TERM2突变体抗体结合位点(epitope)，为抗人R47H-TREM2突变体单抗体的制备提供依据。

作为优选的技术方案，所述R47H-TREM2多肽合成采用固相Fmoc法合成，包括步骤：

1)去保护