[发明专利]一种携带双自杀基因的可回复永生化肝细胞株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，公开了一种携带双自杀基因的永生化肝细胞株的构建方法以及构建的小鼠胚胎肝祖细胞株。

技术背景

肝功能衰竭(Liver failure)是临床最常见的死亡率极高的肝病症候群，严重威胁着人类的健康。据统计显示，我国每年因为重症肝功能衰竭导致死亡的人数为30～50万。治疗肝衰竭最有效的方法是肝移植，然而由于供肝来源缺乏，仅有不到10％的患者能得到肝移植的机会。生物人工肝(Bioartificial liver，BAL)是以培养肝细胞为基础的体外生物人工器官装置，可暂时代替肝脏进行解毒、分泌、合成、转化等功能，不仅能为肝衰竭患者等待肝移植争取时间，而且可为肝再生恢复创造条件。目前生物人工肝的细胞来源包括：1)原代细胞：包括自体、同种异体或异种的成体肝细胞，由胚肝细胞、骨髓造血干细胞、肝卵圆细胞等分化而来的肝细胞；2)肝细胞株：肝肿瘤细胞株，永生化的肝细胞株等。肿瘤源性的细胞株来源充足，增殖能力强，且具有一定的合成功能，但目前只有C3A细胞株有应用于临床的报道，然而该细胞代谢解毒功能较弱，尚不具备完全的成熟肝细胞功能，并存在着潜在的致癌性和遗传性状的改变，显然用现有的肝肿瘤细胞株来代替肝脏功能还存在着一定的局限性。用于生物人工肝的细胞需要在体外扩增至10⁷数量级并具有成熟的合成代谢解毒功能，但是原代细胞的来源缺乏，而干细胞成肝分化能力有限，这使得如何促进成熟肝细胞的体外增殖分化成为目前研究的一个热点。虽然肝细胞在体内有着强大的增殖潜能，能多次分裂增殖，但在体外分离培养过程中，由于失去了神经体液调节和细胞间的相互作用，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，细胞生存时间短，增殖能力有限，传代困难且易发生变性，这极大地增加了其在生物人工肝应用中的难度和复杂性。因此，如何获得体外增殖良好并具有正常功能的肝细胞，为生物人工肝提供稳定安全的细胞来源变得尤为重要。

研究发现将猿病毒40大T抗原基因(simian virus40large T antigen gene，SV40T)导入正常细胞，可调节细胞周期中的重要调控点，使细胞进入永生化的增殖状态，成为能在体外长期传代培养的永生化细胞系。SV40是双链环状DNA病毒，由5243个碱基对组成，其中早期转录区基因编码的大T抗原为708个氨基酸的磷酸蛋白，具有多向效应：在宿主细胞内可结合p53和pRB，下调其阻止细胞增殖的作用；还能特异性干扰一个或多个细胞周期调节蛋白，使细胞逃逸Ml期，获得额外的增殖力量，继续分裂。李君等用pcDNA3.1(-)质粒将SV40T导入原代成人肝细胞，获得了高分化的永生化人源肝细胞系，此细胞具有原代肝细胞的典型特征和生物学功能，能分泌白蛋白、ALT、AST及LDH，表达肝脏丰富的功能标志。故用此方法能获得大量功能成熟的肝细胞，可为生物人工肝提供充足的细胞来源。

SV40T毕竟是一个外源的病毒癌基因，与宿主细胞DNA发生稳定整合后长期存在于细胞内，具有细胞恶性转化的潜在危险性，并且细胞永生化后可能会因其增殖能力在体内发生癌变。同时，生物人工肝使用过程中外源细胞有可能进入到血液循环，增加了种植瘤形成的可能。近几年来，国内外学者一直对SV40T永生化肝细胞的临床应用安全性进行不断的探索。常见方法有Cre-LoxP位点重组技术，即先将LoxP位点特异修饰的SV40T逆转录病毒导入原代肝细胞，获得永生化细胞株，使其获得体外增殖能力，然后再将Cre重组酶基因通过病毒载体导入细胞，经过特异性位点重组切除SV40T外源基因，使细胞回复到永生化前的状态。另一种方法是把自杀基因整合到永生化肝细胞内，一旦发生恶性转化，用前体药物将其杀灭。

但是目前的这两种永生化方案还是存在各自的缺陷。Cre-LoxP方案中对Cre重组酶活性及LoxP位点重组切除的效率无法控制，不能保证所有的细胞都去除永生化基因，由于永生化回复后细胞内残留的永生化基因是否抑制细胞功能，是否存在导致肿瘤发生和细胞转化危险性等问题有待进一步验证。自杀基因方案虽然增加了细胞体内应用的安全性，但是导入体内的永生化细胞仍有SV40T基因存在，影响细胞在体内的分化及功能成熟。

发明内容

为了解决以上的问题，本发明提供了一种可回复永生化肝细胞株的构建方法，成功获得了携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T永生化基因的可回复永生化小鼠胚胎肝祖细胞株。

本发明的目的是通过以下措施实现的：