[发明专利]适度表达新型枯草芽孢杆菌NADH氧化酶高效发酵生产乙偶姻

说明书

技术领域

利用适度表达新型NADH氧化酶减少NADH依赖型副产物提高乙偶姻产量，本发明属于基因工程和发酵工程领域。具体涉及一种新型NADH氧化酶的筛选、基因工程菌的构建及其发酵生产。

技术背景

乙偶姻天然存在于玉米、葡萄、可可、苹果、香蕉、干酪、肉类等许多食品中。是一种应用广泛、令人喜爱的食用香料，具有强烈的奶油、脂肪、白脱样香气，高度稀释后有令人愉快的奶香气，因此乙偶姻主要用于配置奶香型、肉香型、草莓香型的香精，或直接用于奶制品。我国国家标准GB2760-86明确规定其为允许使用的食品级香料，美国食品和萃取协会(FEMA)安全号为2008。

目前，传统的发酵技术已经成为我国现阶段食用香料行业的研究热点。利用微生物发酵生产香料的基本原理是：通过微生物的自身代谢和微生物生长过程中产生的酶进行的催化作用，经过一系列复杂的生物化学反应，使各种有机物转化为多种具有芳香气味的化合物。目前国内外研究表明某些细菌具有生产乙偶姻的能力，主要包括克雷伯氏菌属(Klebisella)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)以及乳球菌属(Lactococcus)等。但是在大多数菌株代谢过程中，乙偶姻是作为2，3-丁二醇和丁二酮代谢的副产物而存在的，积累浓度较低，从而直接导致了难以利用这些微生物菌种工业化发酵生产乙偶姻。深入的研究。

本实验室保藏有一株以葡萄糖为底物高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌B.subtilis JNA(保藏号CCTCC M209309；专利申请公布号CN101864381A)，在研究中发现其发酵过程会形成部分NADH依赖型副产物，如乳酸、乙醇及2，3-丁二醇，导致乙偶姻产量无法进一步提高，因此考虑通过降低胞内NADH水平来减少这些副产物的生成。NADH氧化酶(NOX，EC1.6.99.3)可以催化NADH形成NAD⁺，因此该酶被广泛的应用到NADH依赖型代谢途径流量的重排上面。但是目前为止，关于枯草芽孢杆菌中NOX的研究还未见报道。

本发明首次报道了来自于自枯草芽孢杆菌的新型NADH氧化酶，在确定该酶相关性质的同时，通过本实验室构建的枯草芽孢杆菌适度表达载体pMA5-P_bdhA(专利申请公布号CN102876703A)，将NADH氧化酶在bdhA基因缺失型菌株中进行表达。在bdhA基因缺失型菌株中，利用适度表达新型NADH氧化酶，达到缩短发酵周期，减少NADH依赖型副产物的目的，最终实现适度表达NOX的工程菌株高效生产乙偶姻。

发明内容

本发明所使用的原始菌种为B.subtilis JNA，该菌株前期发酵葡萄糖合成2，3-丁二醇，后期逆向转化为乙偶姻，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学；保藏编号为：CTCCM209309。

本发明的主要研究内容：本发明利用分子技术克隆了来自枯草芽孢杆菌的4个假定的NADH氧化酶(简称NOX)，构建重组表达载体并将其转化至B.subtilis JNA，通过酶活力测定及相关酶学性质鉴定，确定来源枯草芽孢杆菌的yodC基因为编码形成水的NADH氧化酶。构建适度表达载体pMA5-P_bdhA-yodC，并将其转化至bdhA基因缺失型B.subtilis JNA，成功构建了适度表达NOX的工程菌株。最终，利用在bdhA基因缺失型菌株中适度表达NADH氧化酶发酵生产乙偶姻，将150g/L葡萄糖转化约为56.7g/L的乙偶姻和1.2g/L的2，3-丁二醇，2，3-丁二醇、乳酸和乙酸分别减少92.3％、70.1％和75.0％，乙偶姻生产效率上升到0.68g/(L·h)，较原始菌株B.subtilis JNA发酵周期缩短1.7倍。

本发明的优点和积极效果是：

(1)本发明首次报道了来自枯草芽孢杆菌的新型NADH氧化酶，并确定了该酶酶学相关性质，为枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻减少NADH依赖型副产物提供了一定的理论可能。

(2)本发明通过在bdhA基因缺失型菌株中适度表达NADH氧化酶，实现高效生产乙偶姻的方法，最终适度表达NADH氧化酶的工程菌株将150g/L葡萄糖转化为约56.7g/L的乙偶姻和1.2g/L的2，3-丁二醇，2，3-丁二醇、乳酸和乙酸分别减少约92.3％、70.1％和75.0％，乙偶姻生产效率上升到约0.68g/(L·h)，较原始菌株B.subtilis JNA发酵周期缩短1.7倍。

附图说明