[发明专利]一种山羊乳酪蛋白源抗菌肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物活性肽技术领域，涉及一种抗菌肽及其制备，特别涉及一种山羊乳酪蛋白源抗菌肽的制备方法。 

背景技术

生物活性肽是由氨基酸通过肽键相连的、具有调节机体生理功能和为机体提供营养的肽类化合物。活性肽的调节功能涉及激素、神经、细胞生长和生殖等各个领域。全世界的科学工作者已经从不同的动植物个体以及微生物中分离鉴定出了2000多种活性肽。 

由于抗生素的大量使用，耐药菌株和多重耐药菌株的不断增加，使抗感染治疗成为一个棘手难题。近三十多年来，新型合成抗生素药物研究进展缓慢，抗菌肽正是在这种形势下出现的一类具有发展潜力的新型抗菌药物。抗菌肽又叫抗微生物肽或天然抗生素，一般是由10～50个氨基酸组成的一类小分子肽类物质。它广泛存在于生物体内，包括细菌、真菌、植物、昆虫、两栖动物和哺乳动物等。天然的抗菌肽是一类由基因编码或者经大分子蛋白质水解产生的小分子多肽，具有广谱抗细菌、真菌、病毒等活性。抗菌肽除具有广谱抗微生物活性外，还具有耐高温、热稳定好的特性，并对细菌毒素具有中和作用，其作用机制独特，不易产生耐药性，这将为解决细菌对传统抗菌药物日益增强的耐药性这一棘手难题提供新途径，有望给临床医药学、食品和化妆品加工、动物和植物转基因技术等领域带来广阔的开发应用前景，尤其在食品保鲜方面，可以作为绿色食品保鲜剂使用，对降低合成防腐剂的副作用方面具有重要价值。 

乳是新生哺乳动物的主要食物来源，酪蛋白是牛乳中的主要蛋白质，约 占牛奶中蛋白质总量的80％，在酶解过程中可以产生促进矿质元素吸收、抗菌和抗氧化等多种活性肽。牛乳的抗菌特性最初由Jones和Simms于1930年发现，他们鉴定了一种能够抑制链球菌生长的物质命名为乳烃素(lactenin)；Hill等(1974)通过凝乳酶水解牛α_s1-酪蛋白，得到了第一个从牛α_s1-酪蛋白分离出来的抗菌肽Isracidin；国内胡志和等(2003)、翟青新等(2006)均用胰蛋白酶酶解酪蛋白制备抗菌肽，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较好抑菌作用；Birkemo等(2009)从牛初乳中分离并鉴定出三种抗菌肽。 

山羊奶是北方仅次于牛奶的第二大奶源，山羊乳酪蛋白与牛乳的酪蛋白具有一定的同源性，但在酪蛋白质的构成、同一组分蛋白的氨基酸序列等方面存在很大的差异，以山羊乳酪蛋白为原料同样能获得多种活性肽，如抗氧化肽和抗菌肽。 

根据申请人所进行的资料检索，已授权的中国专利申请基本都属于乳铁蛋白抗菌肽，例如，乳铁蛋白抗菌肽及其制备方法与它们的用途(专利号：ZL200810110996.6)，一种酶法制备乳铁蛋白抗菌肽的方法(专利号：ZL200710190609.X)和一种牛乳铁蛋白工程菌及抗菌肽牛乳铁蛋白素的制备方法(ZL200610166536.6)等，因为乳铁蛋白本身就有抗菌作用，经过酶水解后只是提高了乳铁蛋白的抗菌作用和利用稳定性。乳酪蛋白抗菌肽也有报道，中国专利(专利号：ZL201010104660.6)公开一种牛乳源抗菌肽的制备方法，选用胃蛋白酶水解乳酪蛋白，所得抗菌肽的分子量在7000-140000之间。由于分子量为140000的抗菌“肽”就根本不能称为“肽”，而实质上还是蛋白质。 

中国专利申请(公开号：CN201210218734.8)公开一种乳酪蛋白抗菌肽的制备方法，该方法选用胰蛋白酶水解酪蛋白，所得抗菌肽的分子量在3000-10000之间，从文献公开的内容，尚不清楚其抗菌肽的一二级结构。 

发明内容

针对一般抗菌素的耐药性及合成防腐剂存在的副作用，以及目前乳源抗菌肽存在的缺陷，本发明的目的在于，提供一种来源于山羊乳酪蛋白抗菌肽的制备方法，采用木瓜蛋白酶将山羊乳酪蛋白酶解，酶解物经过大孔非极性树脂分离及脱盐，再经过半制备凝胶色谱仪纯化，冷冻干燥，即加工成山羊乳酪蛋白源抗菌肽粉，其分子量均在3000以下。 

为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案： 

一种山羊乳酪蛋白抗菌肽的制备方法，其特征在于，具体按下列步骤进行： 

1)酪蛋白的提取 

山羊乳酪蛋白的提取是将鲜山羊乳离心脱脂后，利用等电点沉淀法将酪蛋白提取出来。 

2)酪蛋白酶解物的制备 

酪蛋白酶解液的制备是用木瓜蛋白酶在规定的底物浓度、pH、温度和加酶量条件下水解规定时间后，灭酶，冷却，离心，上清液真空浓缩后得酶解浓缩液。 

3)抗菌肽脱盐及分离纯化