[发明专利]单酶切载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA重组技术，具体地说，涉及一种单酶切载体的构建方法。

背景技术

表达载体的构建是转基因技术的关键步骤，其主要过程是通过一系列酶切和连接反应将目的基因表达框与载体重组，再将重组后的载体转染宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞中的表达。目前酶切技术主要分为双酶切和单酶切两种。

双酶切是指载体构建时在载体序列上找到2个合适的酶切位点，同时在目的基因的上下游引入相应的酶切位点；然后通过双酶切反应，在载体和目的基因上个形成2个不同的粘性末端；最后通过连接反应，目的基因可以高效的并以特定方向插入到载体中。双酶切反应的优点是载体不会发生自连，目的基因的插入方向确定和较高的连接效率；限制双酶切应用的因素是要求载体合适位置上存在2个酶切位点，而且要求2种限制酶必须在同一种缓冲液中具有高酶切活性。某些特殊的载体或研究者自己构建的载体就难以找到2个合适的酶切位点，这个时候就需要用到单酶切技术。

单酶切是指在载体的目的基因插入位点处只有一种可用的酶切位点，这样目的基因上下游只能导入相同的酶切位点，经过酶切反应后，在载体和目的基因的两端形成了4个相同的粘性末端，最后通过连接反应将目的基因插入载体中。限制单酶切技术应用的主要问题是连接效率低，连接时间长。这是由于酶切后4个粘性末端相同，载体极易发生自身连接，而且目的基因会以2种不同的取向随机整合到载体中，这两个因素极大的降低了单酶切连接效率，只有双酶切效率的 5-10％左右。研究者尝试了很多方法提高单酶切效率，比如载体5，端去磷酸化等，但效率也不高，而且增加了操作步骤难度、以及核酸降解的机会。无论是单酶切和双酶切，其连接一般都是利用T4 DNA连接酶16℃过夜连接，连接时间在10h以上。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种新的提高单酶切连接效率的单酶切载体的构建方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种单酶切载体的构建方法，包括如下步骤：

1)单酶切位点的筛选；

2)在目的基因两端引入酶切位点；

3)对载体和目的基因进行酶切和电泳切胶回收；

4)对目的基因和载体混合液进行温度梯度预处理；

5)使用Takara公司的连接T载体用的solution I(主要成分为T4DNA连接酶+Takara公司生产缓冲液)连接载体与目的基因。

其中，步骤1)根据载体的结构和自身研究的需要确定一个限制性内切酶位点。

其中，步骤2)在目的基因的5’和3’端非编码区设计扩增引物，在上下游引物的5’端引入步骤1)确定的酶切位点，加上酶切位点相应的保护碱基，利用高保真酶扩增目的基因，扩增出5’和3’端含有相应的酶切位点的目的基因。

其中，步骤3)将载体和目的基因分别同时酶切，酶切体系根据实际需要确定，一般40-50μL。酶切反应结束后，酶切产物需要电泳分离并切胶回收，电泳时间不能太长，以10-14min为宜，长时间电泳会损失核酸结构。切胶时紫外不能长时间照射胶面，避免损伤核酸结构。

进一步地，步骤4)载体与目的基因按物质量浓度1：10的比例加 入。

载体和目的基因混合液按以下程序处理：

80℃：3min；

55℃：15s；

45℃：15s；

16℃：30s；

在16℃30s结束后再加入solution I，在16℃下连接90min。

作为优选，步骤4)连接反应的总体系为15-20μL。

(1)80℃，3min的目的是为了增加核酸分子的内能，分子运动加剧，使处于自连状态下的载体分子解开，增加目的基因与载体结合的几率，而双链在这一温度不会解开；

(2)55℃，15s和45℃，15s的目的是通过缓慢降温实现目的基因与载体以粘性末端相连，通过这一系列温度的变化，可以增加目的基因与载体粘性末端配对；

(3)16℃,30s的目的是使体系温度降到16℃，加入连接反应液solution I，避免高温影响solution I中T4连接酶的活性。加入solution I时沿管壁加入，动作要轻，不必混匀。

前述的构建方法中，目的基因与载体连接后，还可包括如下步骤：

A、转化感受态细胞

连接反应完成后4℃保存，或直接转化感受态。