[发明专利]表达鹦鹉热衣原体pmpD-N基因的HVT重组体及其构建

说明书

技术领域

本发明涉及表达鹦鹉热衣原体pmpD-N基因的HVT重组体，本发明还涉及该重组病毒的制备方法及应用。

背景技术

鹦鹉热衣原体是一种自然疫源性病原体，宿主范围广泛，能引起人、哺乳动物和鸟类的多种疾病。其天然宿主为鸟、低等动物和野生动物，主要在鸟类和家禽中传播。家禽感染后造成多系统的，或致死性疾病，临床表现为结膜炎、厌食、体重减轻、腹泻、黄痢、鼻窦炎、打喷嚏、流泪和呼吸困难。剖检后发现病理变化主要表现为肝脏坏死、肝脾肿大、纤维素性气囊炎、腹膜炎和心包炎等。鹦鹉热衣原体最早爆发于1929~1930年间，是由亚马逊绿鹦鹉引发的在欧洲和美洲的大流行。过去的30年中，在美国，中国，澳大利亚，欧洲的火鸡鸭场及鸡场均有流行。

衣原体的感染往往呈隐形形式，其寄生于受感染细胞的内部，造成进行性、不可逆性的病理变化，很难用抗生素清楚感染的病原。因此，寻找预防衣原体感染的有效疫苗是衣原体研究的长期目标。迄今，已有多种禽用衣原体疫苗获得过研究，包括全菌灭活疫苗、弱毒疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗和活载体疫苗等。灭活苗是用物理、化学方法杀死衣原体，但仍保持其免疫原性的一种生物制剂。然而死苗不能刺激特异性CTL细胞产生，而细胞免疫应答在最终清除衣原体感染中起关键作用。因此灭活苗不适宜做衣原体疫苗免疫。减毒活苗可以有效预防衣原体的感染，但理论上活疫苗具有回复毒力、导致衣原体污染环境及引起免疫病理损伤的潜在风险。因此，衣原体活疫苗的发展前景受到限制。为去除衣原体全菌疫苗的副作用物质，避免减毒活疫苗回复突变的危险，从20世纪80年代开始，亚单位疫苗成为衣原体研究的重点。MOMP为衣原体外膜的主要结构蛋白和免疫优势抗原，可诱导机体产生特异性中和抗体和T细胞介导的免疫应答，因而是衣原体疫苗靶抗原的最佳选择。然而，各型衣原体MOMP的抗原决定簇变异较大，一种疫苗不易对各型衣原体感染均具有保护性，而且MOMP的天然构型与其保护性效果密切相关，因此亚单位疫苗在临床应用上也存在很大的障碍。DNA疫苗是预防衣原体感染的很有价值的方法。Vanrompay等将A型鹦鹉热衣原体编码MOMP的基因ompA克隆到真核表达质粒pcDNA1上，用包被有金粉的pcDNA1/MOMP质粒DNA通过基因肌肉或是粘膜免疫接种火鸡，在火鸡中检测到了类似于天然MOMP结构的重组MOMP，并检测到了相应的抗体， 同时产生了良好的CTL反应。但DNA疫苗的稳定性以及转基因的风险均限制了该疫苗在家禽使用中的前景。

重组活载体疫苗是指利用基因工程技术，将保护性抗原基因（目的基因）转移到相应的载体中，通过和病毒基因重组后表达出保护性抗原蛋白质的活疫苗，这种疫苗可通过1次免疫预防多种疾病，明显降低疫苗的成本，简化免疫程序，增加免疫覆盖率，同时这种疫苗中的保护性抗原成分单一，有利于建立免疫监测方法，因此利用活的疫苗病毒作为载体研究重组活载体疫苗是未来疫苗的一个重要方向。Zhou等利用重组的腺病毒表达MOMP，免疫鸡后也获得了很好的免疫效果，说明以活病毒载体制备疫苗方法可成为衣原体疫苗研究的一个重要手段。

随着分子生物学的发展，一些基因组庞大的病毒的分子位点和结构被逐步搞清楚，从而奠定了这些病毒在重组活载体疫苗研究中的地位。禽病疫苗的研究中，用于构建重组疫苗的病毒载体主要有：鸡痘病毒（FPV）、禽腺病毒以及疱疹病毒，包括鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）和鸡马立克氏病病毒（MDV）。目前应用较为广泛的病毒活载体是痘病毒载体，痘病毒作为载体有很多优点，如插入外源基因组大、不会整合入宿主染色体、免疫方法简单、疫苗生产成本低等优点，因此重组鸡痘疫苗已广泛应用到生产实践中。但痘病毒作为载体一个最重要的缺点是能引起载体效应，因而痘病毒载体疫苗不能用于接种过痘苗的禽,而且由于机体产生的抗痘病毒抗体也会消灭载体病毒，因而痘病毒载体疫苗也无法克服母源抗体的干扰。

火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkey, HVT）为鸡马立克氏病病毒血清III型。 HVT对鸡群不具有致病性，通常用作疫苗来预防由MDV造成的商品鸡肿瘤发生、免疫抑制和致死性疾病。HVT和MDV是在血清学上具有相关性的疱疹病毒，由HVT诱导产生的免疫反应对MDV具有明显的交叉保护。HVT可诱导先天性和适应性免疫反应的产生。上调自然杀伤细胞反应活性，产生病毒特异性的体液和细胞免疫反应。HVT基因组结构的特点以及其持续在鸡体存在的特性，使其成为用于构建重组禽疫苗的很好的载体。目前，基于HVT的载体禽用疫苗已有传染性法氏囊病、新城疫、高致病力禽流感等。但目前尚无衣原体与HVT的基因工程二联疫苗的相关报道。