[发明专利]一种生物巯化物的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种用于检测样品中生物巯化物的方法。

背景技术

生物巯化物，包括半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽等等，在生物体内各生化过程起着至关重要的作用。它在体内的含量对维持生物机体内氧化还原环境平衡等方面发挥着重要作用。近年来若干研究表明，生物机体内生物巯化物浓度的变化常与各类疾病息息相关，当其在生物体内表达过低时，常会引起生长趋缓、肝脏损伤等，而当其在机体内呈现高表达时又会引起阿尔兹海默病、帕金森综合症及心血管疾病的发生。因而，生物机体内生物巯化物的检测可以为这些疾病的临床诊断和治疗提供许多重要的信息。

现今检测生物巯化物的技术主要包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、荧光光谱测定法等等。这些方法在检测灵敏度、选择性、检测时间和稳定性方面各有优势，但同时也存在操作繁琐、仪器设备昂贵等不足之处。因此，发明一种简单、直观、可行的生物巯化物检测方法显得非常迫切。

比色法是通过比较或测量有色物质溶液的颜色深浅度来确定待测组分含量的方法，常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律为基础。目视比色法，只需用眼睛观察就可得到直观的实验现象，光学比色法只需要使用紫外分光光度计就可以得到灵敏的实验结果，所需实验设备简单、操作简便。

发明内容

本发明的目的是为了建立一种生物巯化物的简便检测方法。该方法通过检测体系中一种常见显色剂3，3’，5，5’-四甲基联苯胺所形成的蓝色显色复合物的生成量，即可实现生物样本中生物巯化物的间接检测。

一种生物巯化物的检测方法，利用生物巯化物和银离子的强亲和力，在酸性条件下竞争原本可以使得显色剂3，3’，5，5’-四甲基联苯胺溶液显色的银离子，从而抑制显色剂蓝色复合物的生成，在波长656nm比色测定，通过制定的标准曲线，最终换算成生物巯化物的浓度。

所述的生物巯化物与显色剂3，3’，5，5’-四甲基联苯胺之间对银离子的竞争，显色剂3，3’，5，5’-四甲基联苯胺与银离子的终浓度分别是1mM及100μM。

本发明生物巯化物的检测方法，于室温(约25℃)、pH4.0条件下，加入生物巯化物样品 反应1小时，在波长340nm-780nm进行比色测定，利用656nm的吸收峰进行定量。

本发明生物巯化物的检测方法中，采用了一种常见的生物巯化物样品半胱氨酸(分析纯)为标准样品，测定标准曲线，然后再根据样品比色值结果测算实际生物巯化物的含量。

本发明的有益效果在于，建立了一个可用实际样本生物巯化物的检测方法，通过溶液颜色的变化实现生物样本中生物巯化物的快速检测的同时，兼具操作简单、成本低廉等优点，适用于血清、细胞裂解液等生物样本中生物巯化物的测定，在实际生产生活中有一定的应用价值。

附图说明

图1为100μM半胱氨酸及对照实验的紫外可见吸收光谱图。体系中包括1mM3，3’，5，5’-四甲基联苯胺、100μM银离子及(a)对照组，水；(b)对照组，半胱氨酸的巯基阻断剂N--乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)；(c)实验组，100μM半胱氨酸；(d)对照组，100μM半胱氨酸及巯基的阻断剂NEM。

图2为检测不同浓度半胱氨酸(从a到j分别为0.5μM、1μM、10μM、25μM、50μM、75μM、100μM、200μM、500μM、1000μM)时得到的紫外可见吸收光谱图。

图3为紫外吸收峰值(Abs656nm-753nm)与半胱氨酸浓度的关系图，插入图为半胱氨酸浓度在0.5μM-50μM范围内，紫外吸收峰值(Abs656nm-753nm)与半胱氨酸浓度的线性关系图，插入图为半胱氨酸的标准曲线。

图4为检测特异图，体系中含有20种不同氨基酸(从左到右分别为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸)对应的紫外可见吸收光谱吸收峰值(Abs656nm-753nm)柱状图。

具体实施方式

实施例一：实验原理验证