[发明专利]一种获得具有快速生长能力的分枝杆菌菌种的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种获得具有快速生长能力的分枝杆菌菌种的方法，属于菌种选育技术领域。

背景技术

雄烯二酮是从精巢或尿中提取出的具有雄性激素作用的一种甾类化合物，单纯的依靠化学方法生产雄烯二酮远远达不到市场的需求。通过微生物选择性降解甾醇侧链，可得到制备甾体激素类药物的重要中间体雄烯二酮(雄甾-4-烯-3,17-二酮，androst-4-ene-3,17-dione，简称AD)。因此采用微生物发酵生产生产AD具有产品纯度高、生产成本低、周期短等特点，是当前的一大趋势。

但目前市场上雄烯二酮仍处于供不应求的状态，主要原因是雄烯二酮生产厂家少，市场需求大。本企业以生产雄烯二酮为主，生产上存在的困难是：菌株转化能力较强，但种子生产周期较长，易染菌，增加动力消耗，增加生产成本，严重影响生产效益。

发明内容

本发明利用原生质体融合技术，将具有不同特性的菌种进行融合，能够得到具有两种生长特性的新菌株，从而缩短种子生长周期，减少动力消耗，降低生产成本；同时拓宽了微生物的遗传种质资源，丰富了基因库的内容，促进了微生物菌种选育技术的进步。

一．高转化能力分枝杆菌菌株Ⅰ的获得，其步骤是：

通过分离、初筛和复筛选，取一株能够将植物甾醇高效转化的分枝杆菌菌株作为初始菌株Ⅰ。

所用斜面平板筛选培养基为（g/L）：葡萄糖20，黄豆饼粉5，柠檬酸3，磷酸二氢钾,0.5，尿素0.5，七水硫酸0.1，硫酸亚铁0.01，碳酸钙2，琼脂20；种子瓶培养基为(g/L)：葡萄糖30，黄豆饼粉10，柠檬酸3，硫酸铵,15，磷酸二氢钾0.5，七水硫酸0.1，硫酸亚铁0.01，碳酸钙2，玉米浆5，泡敌0.2，pH值8.0。；发酵瓶培养基为(g/L)：硝酸钠6，磷酸氢二铵0.5，玉米浆15，豆油160，甾醇35.pH值8.0。

二．具有快速生长能力的分枝杆菌菌株Ⅱ的获得，其步骤是：

通过分离、初筛和复筛选，取一株能够将植物甾醇高效转化的分枝杆菌菌株作为初始菌株Ⅱ

所用斜面平板筛选培养基为：BD琼脂培养基（REF213000），种子瓶培养基为：葡萄糖5，硝酸钠6，磷酸氢二铵0.5，丙三醇1.5，泡敌0.1；pH值8.0；发酵培养基为：硝酸钠6，磷酸氢二铵0.5，玉米浆15，豆油160，甾醇35.pH值8.0。

三．菌株Ⅰ和Ⅱ的原生质体融合，其步骤是：

（1）孢子悬液的制备：将菌株Ⅰ和Ⅱ分别制备成孢子悬液。

（2）菌体的培养：取适量孢子悬液接入种子瓶内，在适宜条件下将菌体培养至对数生长期。

（3）原生质体的融合：将菌株Ⅰ和Ⅱ进行原生质体融合，包括原生质体的分离、再生以及原生质体的融合。

（4）筛选合适菌株：随机挑选若干融合后长出的菌株，制备母斜面，培养成熟后接摇瓶进行发酵培养，测定其效价。

（5）遗传稳定性考察：对筛选得到的合适菌株进行多次传代试验，考察其遗传性状的稳定性，最终筛选得到转化能力强且生长速度快的菌株。

（6）发酵罐试验：将所筛选的合适菌株进行发酵罐试验，测定其效价。

以上所述的原生质体融合过程中溶酶菌浓度为2.5mg/ml，34℃，酶解1h；热灭活温度为60℃，时间为10min。

筛选配方、摇瓶培养和发酵配方同一。

本发明的优点及效果

1.本发明中利用原生质体融合技术对菌株进行筛选，不存在远源杂交不融合的缺点，所筛选出的菌种稳定性好，是一种比较理想的微生物菌种定向选育方法。

2.利用原生质体融合技术时遗传物质得到充分重组，获得转化能力强且生长速度快的重组子。有效地提高菌株生长速度，缩短了发酵时间，减少了动力消耗，降低了生产成本。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。

一．选取一株高转化能力的分枝杆菌菌株Ⅰ

1.分离

从保存的原始菌株甘油管中吸取1ml菌悬液，梯度稀释涂布到原始配方的的平板上，30±1℃，湿度30%-60%培养7天。

2.制备斜面菌种

挑选菌落直径为4mm以上，形态边缘不规则，橙黄色的单菌落均匀涂布到斜面培养基上，30±1℃，湿度30%-60%培养7天。

3.摇瓶考察