[发明专利]一种桑树子叶不定芽的诱导方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种子叶不定芽直接诱导方法，为桑树转基因的受体部分，属于植物基因工程领域。 

背景技术

在众多的植物再生体系中，通过诱导叶片不定芽、体细胞胚和原生质体再生的方法属单细胞起源，适合用于植物转基因的受体系统。在众多成熟的转基因技术中，花生、杨树等植物大多采用侵染叶片产生不定芽再生植株的方式，棉花、水稻等作物大多采用侵染下胚轴诱导胚性愈伤经过体胚方式再生植株或先诱导胚性愈伤，再侵染胚性愈伤，通过体胚萌发方式再生植株。原生质体系统作为转基因的受体系统用得较少，主要原因是这一方法不经济，成本高，难度也大。相比体细胞胚体系和不定芽体系，不定芽再生体系有明显有优势，如果同一种植物同时能运用体细胞胚方式和不定芽再生方式进行转基因，一般都会采用不定芽再生的方式。直接诱导不定芽时间周期短，一般诱导3个星期左右，不定芽开始发生，再发育4周左右可以移瓶生根，整个周期在3个月左右；而采用诱导体细胞胚的方式，步骤繁多，时间长，从浸染开始到获得植株需要9个月至1年时间。采用不定芽再生的方式，畸形苗少，再生苗长势旺，而采用体细胞胚的方式有较多畸形苗。 

王勇等学者公开了桑子叶不定芽的诱导与再生植株，用桑子叶为受体开展桑树基因工程研究作准备，但是其细胞分裂素与植物生长素浓度比较低，并且是采取一次诱导的方法，不考虑不定芽发生和发育对激素浓度要求的不同，所以子叶不定芽诱导率很低；此外，该方法缺乏组织学和解剖学的方法证明所诱导的芽为不定芽还是胚芽来源。 

发明内容

解决的技术问题：针对现有技术的不足，本发明提供了一种桑树子叶不定芽的诱导方法，根据不定芽发生和发育对激素浓度要求的不同进行递度诱导，在高浓度细胞分裂素（6-BA）下诱导不定芽发生的启动，在不定芽发生启动后转入较低浓度细胞分裂素（6-BA）中促进不定芽发育，方法稳定，诱导率高。 

技术方案：本发明提供的桑树子叶不定芽的诱导方法，包括以下步骤： 

（1）种子吸胀与培养

将桑树种子清水浸泡12h后，用流水冲洗1-2h，其次用7%次氯酸钠溶液或0.1%氯化汞溶液灭菌15分钟，然后用灭菌蒸馏水冲洗3-4次。

（2）子叶分离 

将吸涨灭菌好的桑树种子置于解剖镜下，用尖嘴镊撕去种皮，将两片子叶分开，用手术刀将子叶从基部切除。

（3）不定芽诱导 

将分离得到子叶接入不定芽诱导培养基1上，置于光照培养箱内26℃，光周期16L/8D诱导培养，培养3周后转入不定芽诱导培养基2中。

所述不定芽诱导培养基1为：MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+K8P维生素+10%椰子汁+3mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）+0.1mg/L萘乙酸（NAA），PH值为5.8-6.0。 

所述不定芽诱导培养基2为：MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+K8P维生素+10%椰子汁+2mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）+0.1mg/L萘乙酸（NAA），PH值为5.8-6.0。 

（4）不定芽生长 

不定芽形成后，当不定芽形成3-4片叶片时移入桑树组织培养继代培养基中，继代培养基为：MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+B族维生素+0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）+0.1mg/L萘乙酸（NAA），PH值为5.8-6.0。

（5）不定芽生根 

当不定芽长至1厘米时，移入生根培养基形成完整植株，生根培养基为：1/2MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+B族维生素+0.1mg/L吲哚丁酸（IBA），PH值为5.8-6.0。

有益效果：本发明为桑树转基因提供了一个有效的受体再生系统，时间周期短，不定芽诱导效果好，结果稳定，重复效果好，为大规模转基因桑树创造了可能，实现桑树种质通过转基因手段进行种质创新与储备。 

附图说明

图1为子叶分离图；图2为诱导子叶产生的不定芽； 

图3为桑树子叶不定芽扫描电镜照片；图4为桑树子叶不定芽发生组织切片。

具体实施方式

下面通过实施例的方式对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明范围。 

实施例1 

（1）种子吸胀与培养