[发明专利]用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物及其设计方法

权利要求书

1.一种用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物，其特征在于：该四种致病菌的多重PCR引物分别包括阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物； 

其中，阴沟肠杆菌的上下游引物为： 

P1：5’-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3’； 

P2：5’-CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3’； 

产单核细胞增生李斯特菌的上下游引物为： 

P3：5’-TTCCGCAGAGGACAGTGATG-3’； 

P4：5’-CATATTCCACTTTAACCGTG-3’； 

嗜水气单胞菌的上下游引物为： 

P5：5’-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3’； 

P6：5’-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3’； 

副溶血弧菌的上下游引物为： 

P7：5’-TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’； 

P8：5’-GTTGATGACACTGCCAGATGC-3’。 

2.根据权利要求1所述的用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物，其特征在于：所述阴沟肠杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为1250bp，所述产单核细胞增生李斯特菌引物对应的PCR扩增片段大小为768bp和272bp，所述嗜水气单胞菌引物对应的PCR扩增片段大小为483bp，所述副溶血弧菌引物对应的PCR扩增片段大小为454bp。 

3.一种根据权利要求1所述的用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物的设计方法，其特征在于：包括以下步骤： 

步骤1，利用引物设计软件设计同时检测阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为20-24个，引物的熔解温度Tm值为55℃-65℃，引物的GC％为40％-60％； 

步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不形成引物二聚体的引物； 

步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的GC％和碱基数进行比较，当引物的碱基数均相同且内侧引物的GC％小于外侧引物的GC％，或者当引物的碱基数不完全相同且内侧引物的碱基数比外侧引物少一个碱基时，判断为竞争状态劣势引物，进行步骤4；否则判断为竞争状态优势引物，进行步骤5； 

步骤4，再次筛选竞争状态引物，具体步骤为：重复步骤2，对所保留的引物按照 步骤3进行再次判断； 

步骤5，利用PCR方法对竞争状态优势引物进行扩增验证； 

步骤6，去除扩增引物中的竞争状态劣势引物，获得多重PCR引物组合。 

4.一种应用如权利要求1所述的用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物的多重PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤： 

1)细菌的初步分离：从培养基中提取基因组DNA，备作PCR模板； 

2)多重PCR扩增包括：a、多重PCR扩增反应体系：取上述DNA模板2～8μL，反应体系为20-30.0μL，各反应产物分别为TaqDNA聚合酶5U/μL，0.1-0.25μL，PCR缓冲液2.5μL，脱氧核糖核苷三磷酸混合物10mmol/L，2-3.5μL，引物P1、P2各0.5-2μL，P3、P4各0.75-1.5μL，P5、P6各0.75-1.5μL，P7、P8各0.25-1.0μL，余量用重蒸水补足；b、扩增反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，循环30次，72℃终末延伸10min；c、将步骤b的扩增产物进行电泳检测及结果分析。 

5.根据权利要求4所述的用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物的多重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤a中引物P1、P2各2μL，P3、P4各0.75μL，P5、P6各0.75μL，P7、P8各0.25μL。