[发明专利]一株过表达fusA基因工程菌的构建方法及其应用

权利要求书

1.一株过表达fusA基因工程菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum subspecies lactofermentum）WY001/ pDXW-8-fusA，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.2014233。

2.一株过表达fusA基因的基因工程菌WY001/ pDXW-8-fusA的构建方法，其特征在于PCR扩增克隆延伸因子EF-G基因fusA，将基因片段连接到表达载体pDXW-8，然后电转入谷氨酸棒杆菌WY001中，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌WY001/ pDXW-8-fusA；步骤如下：

（1）设计引物扩增fusA

上游引物：5’-CTAGCTAGCA GAAGGAGTAA ATCGGTGGCT  CAAGAAGTGC TTAAG-3’，下划线为NheI酶切位点；

下游引物：5’-AACCCTCGAG TTAGGAAGCG GTGCCGTTGC-3’，下划线为XhoI酶切位点；

（2）将PCR产物和表达载体pDXW-8分别用NheI/XhoI双酶切，回收后，将fusA和pDXW-8以6∶1～3∶1的摩尔比例，用T4连接酶在16℃连接2h，构建重组表达载体pDXW-8-fusA；

（3）然后将重组质粒pDXW-8-fusA导入谷氨酸棒杆菌WY001中，在含有卡那霉素50μg/mL的LBHIS固体培养基30℃培养48h，筛选转化子；

（4）提取筛选的转化子的质粒，用PCR验证转化子，从而获得过表达fusA基因的基因工程菌WY001/ pDXW-8-fusA。

3.用权利要求2所述方法构建的基因工程菌WY001/ pDXW-8-fusA的应用，其特征在于在摇瓶培养生产氨基酸。

4.用权利要求2所述方法构建的基因工程菌WY001/ pDXW-8-fusA的应用，其特征在于在发酵罐生产氨基酸。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于生产的氨基酸为L-异亮氨酸及赖氨酸。