[发明专利]表达高效木聚糖酶重组质粒及重组毕赤酵母菌的构建方法

权利要求书

1.一种表达高效木聚糖酶重组质粒，其特征在于，序列如序列表Seq ID No.1所示。

2.一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，其特征在于，构建过程包括如下步骤：

步骤(1)根据毕赤酵母密码子的偏好性，对木聚糖酶密码子进行优化；

步骤(2)pPICZαA-XynB-opt单拷贝表达载体的构建；

步骤(3)pPICZαA-(XynB-opt)₂双拷贝表达载体的构建；

步骤(4)重组质粒的电转化和表达。

3.根据权利要求2所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)pPICZαA-XynB-opt单拷贝表达载体的序列如序列表Seq ID No.2所示。

4.根据权利要求2所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)pPICZαA-XynB-opt单拷贝表达载体的构建的具体步骤如下：在优化合成的目的基因两端设计酶切位点，分别为EcoR I和Xba I，将该基因连接在pPICZαA载体上；将构建成功的重组表达载体pPICZαA-XynB-opt转化到大肠杆菌感受态E.coil top10中，在LB低盐培养平板上筛选阳性克隆。

5.根据权利要求2所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)pPICZαA-(XynB-opt)₂双拷贝重组质粒的构建的具体步骤如下：将pPICZαA-XynB-opt重组质粒分别用Bgl II单酶切，BamH I和Bgl II双酶切；然后进行酶切产物的回收后连接；并将连接产物转化入E.coil Top10感受态细胞，待长出可见菌落后，筛选出双拷贝重组质粒。

6.根据权利要求2所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)重组质粒的电转化和表达的具体步骤如下：将pPICZαA-XynB用Sac II内切酶单酶切使其线性化；同时，将单、双拷贝的重组质粒用限制性内切酶Bgl II单酶切分别使其线性化；经乙醇浓缩后，电转化入毕赤酵母GS115中，电转化条件为：2,000V，4-5ms；将重组菌涂布于含有100μg/mL Zeocin的YPDS平板上，28℃培养2-3天直至长出清晰菌落，筛选出高活性阳性克隆。

7.根据权利要求2所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，其特征在于，在诱导120小时后表达出的木聚糖酶活性最高，达到15158.23±45.11U/mL。

8.根据权利要求2所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，其特征在于，表达的木聚糖酶经纯化达到电泳纯，比酶活为6853.00±20.08U/mg。