[发明专利]检测细胞内标靶的颗粒

说明书

分案说明

本申请为申请日为2008年2月11日、申请号为200880011218.X、发明名称为“检测细胞内标靶的颗粒”的专利申请的分案申请。

资助公开

本发明由政府支持，资助来自Cancer Center for Nanotechnology Excellence(NCI/CCNE)奖励的资金IU54-CA119341、NIH Director's Pioneer Award奖励的资金5DPIOD000285，和NSEC奖励的资金EEC-0647560。政府对本发明具有一定权利。

技术领域

本发明涉及使用纳米颗粒检测细胞内标靶分子浓度的方法，其中所述纳米颗粒包括可以特异性连接标靶分子的结合部分，且其中所述连接导致在连接标靶分子后可检测标靶中可测定的变化。

背景技术

标记的寡核苷酸广泛地用作检测特异性大分子标靶如核酸和蛋白质的探针。它们与标靶高特异性结合的能力使得它们可以用在体外分析如聚合酶链式反应(PCR)方法中。然而，将这些类型的标靶特异性探针递送进入活细胞存在很大挑战，因为细胞对核酸摄入具有天生的抗性，且包含除去这些外源遗传物质的多种途经。因此，人们对将这些物质以保持其特异性结合性质和荧光信号转导能力的方式递送进入细胞的方法很感兴趣。

寡核苷酸-纳米颗粒缀合物的发现和随后的发展为分子诊断学(Elghanian等,1997,Science111:1078-1081；Nam等,2003,Science308:1884-1886)和材料设计(Mirkin等,1996,Nature382:607-609；Alivisatos等,1996,Nature382:609-611；Demers等,2003,Angew.Chem.Int.Ed.40:3071-3073)提供了多种新的机会。最近，已经表明寡核苷酸功能化的纳米颗粒进入细胞并起到控制基因表达的反义试剂的作用(Rosi等,2006,Science312:1027-1030)。这些“反义颗粒”不是简单的递送载体(Sandhu等,2002,Bioconjugate Chem.13:3-6；Tkachenko等,2003,J.Am.Chem.Soc.125:4700-4701)，而是单个实体调节和转染试剂，所述试剂经历细胞内在化，抵抗酶促降低并以比游离寡核苷酸大两个数量级的亲和常数结合细胞内标靶(Lytton-Jean和Mirkin,2005,J.Am.Chem.Soc.127:12754-12755)。此外，它们可以很容易地被强力的(即高度稳定的)标记材料如锁核酸修饰(Seferos等,2007,ChemBioChem8:1230-1232)且在基因调节所需的条件下没有毒性。实际上，已经显示出，与溶液中缺少寡核苷酸不同，寡核苷酸修饰的金纳米颗粒容易大量被细胞吸收。此性质导致发现可将寡核苷酸修饰的金纳米颗粒用作细胞内基因控制的试剂，在此处它们提供DNA的快速细胞内递送，且还增加细胞中基于协同性质的寡核苷酸的功效。这些寡核苷酸功能化的纳米颗粒已经显示出进入各种细胞类型，且可以用来引入寡核苷酸的高局部浓度。

以前也显出与DNA致密功能化的金纳米颗粒以高度协同方式结合互补DNA，导致结合强度比未与金纳米颗粒连接的类似DNA链的所测结合强度高两个数量级。除上述那些用途之外，此性质使得纳米颗粒对DNA和蛋白质诊断分析特别有用。

一类感兴趣的寡核苷酸是可以检测具有识别序列的特异性标靶的那些寡核苷酸。医学诊断、药物开发和发育和分子生物学应用对这些结构类型(如果将其引入活细胞)特别感兴趣。然而，目前的递送/转染策略缺少其用途所需的特征，如1)低毒性，2)高细胞摄入，和3)提供对引起假阳性信号的酶的抗性。