[发明专利]抗原特异性不成熟DC来源外泌体及其制备和应用方法

权利要求书

1.抗原特异性不成熟DC来源外泌体的制备方法，其特征在于，将髓源性DC用microRNA-146a mimics干扰其成熟，再负载MG的致病肽段Tα_146-162得到抗原特异性不成熟DC，然后依靠抗原特异性不成熟DC分泌得到外泌体。

2.根据权利要求1所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体的制备方法，其特征在于，

具体包括以下步骤：

1)先将microRNA-146a mimics和HiperFect载体混合温育，再加入含GM-CSF的RPMI1640完全培养基培养至第5天的髓源性DC；6小时后更换含GM-CSF的RPMI1640完全培养基；

2)然后将肽段Tα146-162加入步骤1)得到的转染microRNA-146a mimics后的不成熟DC中，培养48小时后，无菌条件下收集培养上清液，离心过滤纯化得外泌体。

3.根据权利要求2所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体的制备方法，其特征在于，

具体包括以下步骤：

1)先将microRNA-146a mimics和HiperFect载体混合温育，再加入含10ng/mlGM-CSF的RPMI1640完全培养基培养至第5天的髓源性DC；体系中microRNA-146a mimics浓度为100-150nM，DC浓度为10^6-10⁸个/ml，6小时后更换含10ng/ml GM-CSF的RPMI1640完全培养基；

2)然后将肽段Tα146-162加入步骤1)得到的浓度为10^6-10⁸个/ml的转染microRNA-146a mimics后的不成熟DC中，肽段Tα146-162终浓度为50-100μg/ml，培养48小时后，无菌条件下收集培养上清液，离心，收集得到的液体滤膜过滤，收集滤后液体，离心得到白色沉淀；吸除上清液，加无菌PBS洗涤，离心，无菌PBS重悬外泌体，超滤离心过滤，得外泌体。

4.根据权利要求3所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体的制备方法，其特征在于，

具体包括以下步骤：

1)先将microRNA-146a mimics和HiperFect载体混合温育，再加入含10ng/ml GM-CSF的RPMI1640完全培养基培养至第5天的髓源性DC；体系中microRNA-146a mimics浓度为100nM，DC浓度为10⁶个/ml，6小时后更换含10ng/ml GM-CSF的RPMI1640完全培养基；

2)然后将肽段Tα146-162加入步骤1)得到的浓度为10⁶个/ml的转染microRNA-146a mimics后的不成熟DC中，肽段Tα146-162终浓度为50μg/ml，培养48小时后，无菌条件下收集培养上清液，4℃离心，300r/min，10分钟，吸取上清液至另一干净无菌的离心管中，4℃离心，2000r/min，20分钟，吸取上清液至另一干净无菌的离心管中，在超净工作台中，将收集得到的液体用0.22μm滤膜过滤，收集滤后液体，4℃离心100000r/min，70分钟，得到白色沉淀；吸除上清液，加无菌PBS洗涤，4℃离心，100000r/min，70分钟，无菌PBS重悬外泌体，100nm超滤离心管4℃离心，300r/min，30分钟，得外泌体。

5.抗原特异性不成熟DC来源外泌体，其特征在于，是由权利要求1-4任一项所述的方法制备而成的外泌体。

6.权利要求5所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体的应用方法，其特征在于，所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体用于制备治疗重症肌无力的药物。

7.根据权利要求5所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体的应用方法，其特征在于，所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体用于制备治疗重症肌无力的药物时，制剂的含量为5μg/25g体重。

8.权利要求5所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体的应用方法，其特征在于，所述的抗原特异性不成熟DC来源外泌体用于制备抑制抗原特异性脾脏细胞的增殖的制剂；或用于制备改变脾脏培养细胞上清液的细胞因子的极化方向的制剂。