[发明专利]一种融合蛋白、其制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品领域，更确切的讲是一种融合蛋白及其应用。

背景技术

细胞因子在机体免疫反应中起着不可替代的作用，白介素-21(IL21)是2000年被发现的一种四螺旋束细胞因子，IL21主要是由活化的CD4+Th细胞分泌。其基因定位于四号染色体长臂26-27(4q26-27)位,编码产生的多肽前体是由162个氨基酸组成，后经过Gly酶切，在第31为断开形成含131个氨基酸残基、分子量为15KD的成熟IL21分子。IL21受体IL21R属于I型细胞因子受体，是由α链和γc链组成，受体分布广泛，主要存在于T细胞、B细胞、NKT细胞、DC细胞及角质化细胞等表面。IL21在固有免疫和适应性免疫中发挥重要的调节作用，是一种重要的的免疫调节因子。由于IL21分子量比较小，分子不稳定，在体内容易降解，因此大制备困难。

现有技术中的IL21的制备方法复杂、成本高昂。现有技术中制备IL21的方法中，直接在大肠杆菌中上清表达，使用的载体为PGEX4-T，表达产物带有GST标签，后期需要将GST标签去除，工艺复杂、成本较高。也有在毕赤酵母中表达，使用的表达载体为PPIC9K，即通过高卡那抗性筛选表达量价高的克隆，由于IL21稳定性较差，因此制备困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有较长半衰期且稳定性良好的细胞因子IL21融合蛋白，及其应用。

本发明的另一目的是提供一种制备所述IL21融合蛋白的方法。

本发明的再一目的是提供一种制备IL21蛋白的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白具有式Ia或式Ib所述结构：

A-B-C(Ia)，或

C-B-A(Ib)

其中，

A为包括白介素-21的多肽元件；

B为连接肽；

C为包括血清白蛋白的多肽元件；

“-”表示连接上述各元件的肽键。

在另一优选例中，所述白介素-21为哺乳动物的白介素-21。优选地，所述白介素-21为人白介素-21。

在另一优选例中，所述血清白蛋白为哺乳动物的血清白蛋白。优选地，所述血清白蛋白为人血清白蛋白。

在另一优选例中，所述元件A的长度为100-200个氨基酸。

在另一优选例中，所述元件A包含SEQIDNO:1中第30-162位所示的氨基酸序列并且长度为133-170个氨基酸。

在另一优选例中，所述元件A的氨基酸序列如SEQIDNO.:1中第30-162位所示。

在另一优选例中，所述的元件C包含SEQIDNO:2中第25-609位所示的氨基酸序列，并且长度为585-650个氨基酸序列。

在另一优选例中，所述元件C的氨基酸序列如SEQIDNO.:2中第25-609位所示。

在另一优选例中，所述连接肽的长度为0-10氨基酸，较佳地为1-5个氨基酸。更佳地，所述连接肽为GGGGS。

在另一优选例中，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:4所示。

在另一优选例中，所述融合蛋白具有以下特性：

a)具有免疫调节活性；

能够调节免疫细胞分化，提高NK细胞，CTL细胞杀伤活性；

b)可抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，促进肿瘤细胞的凋亡；和

c)血浆半衰期≥3天。较佳地≥4天，最佳地≥5天。

在另一优选例中，所述免疫调节活性是指所述融合蛋白能够调节免疫细胞分化，提高NK细胞和/或提高CTL细胞杀伤活性。

在另一优选例中，所述可抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭是指所述融合蛋白能够抑制黑色素瘤细胞迁移和侵袭和/或促进Jurkat细胞凋亡。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码根据本发明第一方面的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体包括根据本发明第二方面的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，

所述宿主细胞表达根据本发明第一方面的融合蛋白；和/或

所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体；和/或

所述宿主细胞基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞(如酵母细胞)。