[发明专利]猪圆环病毒2型IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种猪圆环病毒2型IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡，其特征在于：包括样品吸收区、金标探针区、固化抗体区、吸水区、底板和卡壳；样品吸收区、金标探针区、固化抗体区和吸水区依次粘贴于底板并相互重叠装入卡壳内；所述的样品吸收区包被有纯化的猪圆环病毒2型Cap蛋白；所述的金标探针区包被有金标探针，所述的金标探针为胶体金标记的抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体；所述的固化抗体区依次有检测线T和对照线C，所述的检测线T包被有鼠抗猪IgM单克隆抗体，所述的对照线C包被有羊抗鼠IgG。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡，其特征在于：所述的纯化的猪圆环病毒2型Cap蛋白的包被量为10～50μg；所述的金标探针的标记量为1～30μg/mL，包被量为10~50μL/cm；所述的鼠抗猪IgM单克隆抗体的包被量为0.1～10μg/cm；所述的羊抗鼠IgG的包被量为0.1～10μg/cm。

3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡，其特征在于：所述的样品吸收区的材料为聚酯纤维膜；所述的金标探针区的材料为玻璃纤维膜；所述的固化抗体区的材料为硝酸纤维素膜；所述的吸水区的材料为吸水滤纸；所述的底板的材料为聚乙烯板；所述的卡壳为带可视窗和样品孔的塑料卡壳。

4.权利要求1-3任一项所述的猪圆环病毒2型IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将纯化的PCV2-Cap蛋白包被于聚酯纤维膜上；将胶体金标记的抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体喷涂于玻璃纤维膜上；在硝酸纤维素膜检测线T处包被鼠抗猪IgM单克隆抗体、对照线C处包被羊抗鼠IgG；将包被有纯化的PCV2-Cap蛋白的聚酯纤维膜、包被有胶体金标记的抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的玻璃纤维膜、包被有检测线T和对照线C的硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次组装到聚乙烯板上，装入卡壳内，即得到猪圆环病毒2型IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡。

5.根据权利要求4所述的猪圆环病毒2型IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）纯化的PCV2-Cap蛋白的制备：

利用杆状病毒表达系统构建表达PCV2-ORF2基因的重组杆状病毒，根据PCV2的基因序列设计Cap蛋白特异性引物，引物序列为：

上游引物1：5^，-TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3^，，

下游引物1：5^，-GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3^，；

上游引物2：5^，-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3^，，

下游引物2：5^，-GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3^，；

利用PCR方法从PCV2基因组中扩增PCV2 ORF2基因全序列，将其亚克隆至pFastBac-Dual载体中获得ORF2基因双拷贝的重组质粒pFastBac-Dual-ORF2（2×），将重组质粒pFastBac-Dual-ORF2（2×）转化至大肠杆菌DH10Bac，获得重组杆状病毒质粒；将重组杆状病毒质粒转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒rBac-ORF2（2×）；将重组杆状病毒rBac-ORF2（2×）感染Sf9细胞，使其表达Cap蛋白，收集Cap蛋白，蔗糖密度梯度离心获得纯化的病毒样颗粒的Cap蛋白；

（2）抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备：

1）将前述猪圆环病毒2型Cap蛋白常规免疫Balb/c小鼠，当小鼠血清ELISA效价达到1:10000取脾细胞与骨髓瘤细胞融合；用ELISA法和间接免疫荧光方法筛选阳性杂交瘤细胞；采用有限稀释法亚克隆后得到单抗杂交瘤细胞株；

2）选8周龄雌性BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降植烷，7天后腹腔注射抗圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，接种量为2×10⁶细胞/0.5mL/只，一周后待小鼠腹部膨大抽取腹水，经硫酸铵沉淀纯化即得纯化的抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体；

（3）胶体金标记抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的方法：分别取半径为20～40nm的胶体金20mL调pH值为8.5～9.5，加入抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体 10～600μg，在搅拌条件下使其结合，加BSA作为稳定剂，且使得BSA终浓度为0.1～10%，离心除去未结合的抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒以及凝集物，在离心管底部的深红色沉淀用2mL 0.01M pH值为7.4的PBS溶解，即为胶体金标记抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的复合物；

（4）聚酯纤维膜的制备：将上述纯化的PCV2-Cap蛋白10～50μg用0.01M pH值为7.4的PBS溶解后均匀包被于聚酯纤维膜上，烘干；

（5）玻璃纤维膜的制备：将上述胶体金标记抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的复合物喷涂于玻璃纤维膜上，10～50μL/cm，冻干；

（6）硝酸纤维素膜的制备：检测线T包被鼠抗猪IgM单克隆抗体，包被量为0.1～10μg/cm，对照线C包被羊抗鼠IgG，包被量为0.1～10μg/cm；

（7）试纸卡制备：将聚酯纤维膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次相互重叠组装到聚乙烯板上，用切条机切成4mm宽试纸，装入卡壳内，即得到猪圆环病毒2型IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡。