[发明专利]一种具有诱导活性微载体-细胞复合物的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种具有诱导活性微载体—细胞复合物的制备方法及其应用。

背景技术

目前在组织工程骨构建过程中，种子细胞的使用过程中，在种子细胞与支架材料复合时需进行种子细胞消化收集等破坏其胞外基质的诸多步骤，这将无疑导致所采用种子细胞的活性降低；此外，多采用单一类型的种子细胞-成骨细胞，因其是成骨的主要、直接细胞成分。

造成这一问题的原因在于：用于完成组织工程骨构建的支架材料由于需提供足够的骨功能替代而多为大块形，因此其比表面积、有效粘附面积等细胞培养相关参数均较低，不利于用于种子细胞的体外培养；而目前用于种子细胞体外培养的支架如微载体等均由于降解性差、生物相容性差及造价高等种种原因而不能用于体内移植，进而导致种子细胞在组织工程骨构建过程中需经历反复的消化分离步骤。此外，在骨组织工程构建中，目前对于种子细胞的选择尚以经培养并成骨诱导的BMSCs(骨髓间充质干细胞)为主，由其产生的成骨细胞可直接完成体内成骨活动，因此成为种子细胞的首选，但是，有相关研究表明，骨组织形成过程中，除成骨细胞等实质细胞外，支持细胞如成纤维细胞、内皮细胞等也发挥着不可替代的作用，另有部分实验也证实了在骨组织工程构建中添加成纤维细胞可明显促进成骨质量及成骨速度，但目前尚缺乏较为可行的联合使用成骨细胞及成纤维细胞的方法，使用较多的即为在移植前分别与支架材料完成复合以进一步体内移植。

目前的组织工程骨构建策略中，由于反复的细胞消化分离，其种子细胞活性及细胞利用率均明显降低，进而导致构建效率低下；此外，单纯使用成骨细胞完成组织工程骨构建而进行的体内骨缺损修复效果局限较大，可被大范围的提高，而联合使用成纤维细胞则是得到此效果的可选途径之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有诱导活性微载体-细胞复合物的制备方法及其应用，提高种子细胞利用效率，丰富骨修复种子细胞类型，大范围提高骨缺损修复效果。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种具有诱导活性微载体-细胞复合物的制备方法包括以下步骤：

1)脱钙骨基质微颗粒制备:将牛皮质骨进行冷冻粉碎，然后筛选出粒径小于200μm的颗粒，再将筛选出的颗粒进行脱脂及脱钙处理，得到脱钙骨基质微颗粒；

2)脱细胞真皮基质微颗粒制备：取全厚皮肤，灭菌后用NaCl溶液浸泡，剥离表皮层后用十二烷基苯磺酸钠溶液浸泡，然后用PBS缓冲液漂洗，用胰蛋白酶溶液浸泡消化后，再用PBS漂洗，然后经冷冻粉碎后筛选出粒径小于200μm的颗粒，将筛选出的颗粒进行冻干处理，得到脱细胞真皮基质微颗粒；

3)利用脱钙骨基质微颗粒进行BMSCs培养细胞7-21天，分化为成骨细胞，得到成骨细胞-微颗粒复合物；其中，在培养过程中添加促进分化的成骨诱导液，或直接进行已分化细胞的体外培养；

在37℃、CO₂体积浓度为5％、饱和湿度的条件下，利用脱细胞真皮基质微颗粒进行BMSCs培养细胞7-21天，分化为成纤维细胞，得到成纤维细胞-微颗粒复合物；其中，在培养过程中添加促进分化的成纤维诱导液，或直接进行已分化细胞的体外培养；

按质量比(1-3):1将成骨细胞-微颗粒复合物和成纤维细胞-微颗粒复合物充分混匀，得到具有诱导活性微载体-细胞复合物。

所述步骤1)中将牛皮质骨进行冷冻粉碎前在-80℃保存至少24-36h。

所述步骤1)中脱脂处理的具体条件为：将筛选出的颗粒放入混合液中，搅拌2-6h，得脱脂后的颗粒；其中，混合液为甲醇和氯仿按体积比(1-3):1混合得到的，且每3mL的混合液中加入1g颗粒；脱钙处理的具体条件为将脱脂后的颗粒，加入到0.5mol/L的盐酸溶液中，搅拌36-72h；其中，向每3mL浓度为0.5mol/L的盐酸中加入1g脱脂后的颗粒。

所述步骤2)中NaCl溶液的浓度为1mol/L，用NaCl溶液浸泡的时间为12-24h；十二烷基苯磺酸钠溶液的质量分数为0.5％，用十二烷基苯磺酸钠溶液浸泡的时间为12-24h；胰蛋白酶溶液的质量分数为0.25％，用胰蛋白酶溶液浸泡消化的时间为24-36h。

所述步骤3)中成骨诱导液由DMEM培养液、β-甘油磷酸钠、维生素C和地塞米松组成，成骨诱导液中DMEM培养液为含FBS的DMEM培养液，并且DMEM培养液中FBS的体积分数为10％；β-甘油磷酸钠的浓度为10mmol/L，维生素C的浓度为0.05mmol/L，地塞米松的浓度为100mmol/L。