[发明专利]检测乙型肝炎病毒的PCR引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测领域，涉及一种检测乙型肝炎病毒的PCR引物、引物组、探针及其试剂盒和检测方法。

背景技术

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染呈全球性分布，其感染者已超过二十亿，是我国目前危害最严重的传染病之一。2010年开展的全国乙肝流行病学调查显示，我国目前仍有乙肝表面抗原携带者约9300万人，乙肝和肝癌患者约占全球的四分之一。慢性HBV感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和原发性肝癌的主要原因，并且每年导致100余万人死亡，造成极大的社会及经济危害。

乙肝病毒复制是慢乙肝活动的根本原因，有效的抗病毒治疗可延缓疾病的进展，改善肝脏的生化学及组织学损害，降低肝硬化与肝细胞癌的发病率，降低病死率。抗病毒治疗是慢乙肝治疗史上的里程碑，从病原学角度控制病情的进展，使慢乙肝的治疗取得巨大的进步，但仍存在疗程不确定，停药后复发等问题，其中停药后复发是临床上亟需解决的问题。取得e抗原血清学转换的患者停药后复发率较低，是最可能实现停药的人群。但实际上，即使达到指南停药标准的e抗原（+）患者，仍有相当部分患者出现反弹，其机制尚不明确。有些文献报道停药后HBeAg血清学转换持久率达80-90%，然而也有文献报道停药后复发率达70%。我国最近发表的一项研究，对拉米夫定，阿德福韦和恩替卡韦治疗获得血清学转换后再平均治疗7个月的42 名病人平均随访59个月，只有31%的病人能够维持持续应答（HBeAg消失和HBV DNA < 10,000cp/ml），且复发多发生于停药半年后。如何减少停药后复发，提高停药后持久应答率，是临床上十分重要的问题。

停药时的HBV DNA水平可能是影响停药后复发的因素之一，在临床上可观察到，对HBV DNA抑制能力强的药物停药后复发出现较迟，而对HBV DNA抑制作用较弱的药物，停药后复发出现较早。日本的一项研究15对22例复发的病例及11例获得持久应答的病例进行对比，发现治疗过程中HBV-DNA水平<0.7logIU/ml持续6个月以上可降低停药后复发率。因此，采用高敏感的HBV DNA检测方法来检测停药时的HBV DNA载量，并探讨停药时的HBV DNA水平对复发率的影响，有着重要的临床意义。

目前国内大多数医院普遍采用国产的荧光定量PCR试剂来检测血清HBV DNA载量，其价格便宜，但敏感性较差，检测下限一般为100 IU/ml，对于低于此下限的HBV DNA载量不能再进一步区分，而且对于较高的HBV DNA载量，检测准确性欠佳，检测值往往低于实际水平。目前在国内应用的进口试剂主要有罗氏的COBAS amplicor及COBAS Taqman，其中COBAS Taqman HBV DNA是美国FDA批准的唯一一种采用Taqman技术的试管诊断自动控制技术，是慢性乙型肝炎临床实践指南中推荐的HBV DNA检测方法，它具有灵敏度高、线性范围宽、实时监控、重复性好等优点，检测范围可达20 IU/mL～1.7×10⁸ IU/mL，因其设备昂贵，检测费用高，目前还难以在临床广泛应用。而且，停药时的HBV DNA水平可能低于罗氏的试剂的检测下限20 IU/mL。因此，目前亟需建立一种更加敏感的HBV DNA检测方法，以指导慢乙肝的临床治疗。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过大量实验研究筛选出高灵敏和高特异性的引物序列和检测探针，及特定的PCR反应程序和条件，构建了高敏感PCR检测试剂盒及检测方法，定量检测限可达2 IU/mL，比进口试剂罗氏COBAS HBV检测更敏感。

本发明的目的在于提供检测乙型肝炎病毒的PCR引物。

本发明的另一目的在于提供检测乙型肝炎病毒的PCR引物组。

本发明的再一目的在于提供一种检测乙型肝炎病毒的PCR检测试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种检测乙型肝炎病毒的PCR检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

检测乙型肝炎病毒的PCR引物，其引物序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；或者为该些序列的核苷酸互补序列；

上述引物的核苷酸序列分别如下所示：

SEQ ID NO:1  GGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGT，