[发明专利]抗原嵌合体、抗原组合物、疫苗及其制备方法和试剂盒

权利要求书

1.一种抗原嵌合体，包括：

抗原与能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体的融合蛋白，和

所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体，其中，

所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体选自霍乱毒素B亚单位和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位中的一种，

所述多聚体为五聚体，而且

在所述嵌合体中所述融合蛋白与所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体的摩尔比为1:4，

其中所述抗原嵌合体稳定存在的PH大于7.0，优选pH为8.0。

2.如权利要求1所述的抗原嵌合体，其中所述霍乱毒素B亚单位和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位为其天然组成结构或其能够形成五聚体结构的突变体。

3.如权利要求1或2所述的抗原嵌合体，其中所述抗原的分子量在10至100kD范围内，优选16kD至65kD。

4.如权利要求1至3中任一项所述的抗原嵌合体，其中所述抗原为适用于黏膜免疫的抗原。

5.如权利要求1至4中任一项所述的抗原嵌合体，其中所述抗原选自经由黏膜途径感染人体或动物体的病原菌的抗原，包括但不限于幽门螺杆菌抗原、伤寒抗原、流感血凝素(HA)抗原。

6.如权利要求5所述的抗原嵌合体，其中所述幽门螺杆菌抗原选自幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)、幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A(CagA)蛋白和幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(NAP)中的至少一种。

7.如权利要求1至6中任一项所述的抗原嵌合体，其中所述融合蛋白包含位于所述抗原与所述黏膜免疫佐剂蛋白质单体之间的3个G4S连接体。

8.一种抗原组合物，包含如权利要求1至7中任一项所述的抗原嵌合体，其中所述抗原嵌合体稳定存在的PH大于7.0，优选pH为8.0。

9.一种疫苗，包含如权利要求8所述的抗原组合物和适用于疫苗的赋形剂。

10.如权利要求9所述的疫苗，为口服疫苗、经鼻给药的疫苗或经直肠给药的疫苗。

11.一种用于制备抗原组合物的试剂盒，包括表达如权利要求1-7中任一项中所定义的融合蛋白的载体和表达如权利要求1-7中任一项中所定义的能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体的载体。

12.如权利要求11所述的试剂盒，其中所述载体均为原核表达载体。

13.制备如权利要求1至7中任一项所述抗原嵌合体的方法，包括用权利要求10所述的试剂盒中的载体分别表达所述融合蛋白和所述能形成多聚体的黏膜免疫佐剂蛋白质单体，然后通过复性方法使这两种蛋白结合形成所述嵌合体，其中所述复性方法包括将所述两种蛋白共同放置在含有尿素和二硫苏糖醇(DTT)或尿素和巯基乙醇的复性液中进行复性的步骤，优选所述复性液的pH大于7.0，更优选所述复性液的pH为8.0。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述复性液中尿素的浓度为1.0M至2.5M。

15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述DTT或巯基乙醇的浓度为0.2mM至1.0mM。

16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中在所述复性液中进行复性步骤之前，先将所述蛋白质单体在含6M至9M，优选8M的尿素，且pH为3.0至4.0的缓冲液中预复性0.5至3小时，优选预复性1小时。

17.一种通过复性制备嵌合体的方法，所述嵌合体包含(1)一种蛋白质与能形成多聚体的单体蛋白质的融合蛋白和(2)能形成多聚体的单体蛋白质，通过所述(1)融合蛋白中的单体蛋白质和所述(2)单体蛋白质形成多聚体来形成嵌合体，所述方法包括：

将所述(2)能形成多聚体的单体蛋白质在含6M至9M，优选8M的尿素，且pH为3.0至4.0的缓冲液中预复性0.5至3小时，优选预复性1小时；和

将所述(1)融合蛋白和所述(2)能形成多聚体的单体蛋白质在含有1.0M至2.5M的尿素和0.2mM至1.0mM的DTT或巯基乙醇的复性液中复性形成所述嵌合体，优选所述复性液的pH大于7.0，更优选所述复性液的pH为8.0。