[发明专利]STAG2基因突变序列、其检测方法以及STAG2基因突变在检测膀胱癌中的应用

权利要求书

1.一种检测STAG2基因突变的方法，包括下述步骤：

(1)、从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA；

(2)、对步骤(1)中提取的两种DNA分别进行全基因组测序和全外显子测序；

(3)、对步骤(2)的测序结果进行全外显子组序列比对与体细胞突变检测，得到突变基因；

(4)、采用Sanger测序来验证步骤(3)所得突变基因的体细胞替换和插入与缺失；

(5)、突变基因为显著突变基因的鉴定。

2.根据权利要求1所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，步骤(2)中的全基因组测序过程为用Illumina公司的HiSeq2000平台对从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA，测序方式为双末端测序，测序读长为100bp。

3.根据权利要求1所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，步骤(2)中的全外显子组测序过程为对对从膀胱癌患者的肿瘤组织和外周血中分别提取肿瘤组织DNA和外周血DNA进行随机打断后，按照Agilent Technologies说明书提供的实验流程，采用SureSelect Human All Exon50Mb Kit来捕获全外显子组序列；全外显子组测序平台是Illumina公司的HiSeq2000平台，测序方式为双末端测序，测序读长为100bp。

4.根据权利要求1所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，步骤(3)中对步骤(2)的测序结果进行全外显子组序列比对与体细胞突变检测的过程为：

(a)、去除含有测序接头和包含五个以上未知碱基的低质量序列，用BWA在容缺口模式下将其余的高质量双末端测序序列比对到NCBI人类参考基因组hg18；

(b)、随后用基因组分析工具包GATK对BWA的比对结果进行了局部重新比对；

(c)、根据BWA的比对结果，利用VarScan找出了所有潜在的体细胞替换位点；

基本排除所有的生殖细胞突变的参数及过滤条件：

(i)肿瘤样本和匹配的血液样本在突变位点的基因组位置必须有足够的覆盖深度(≥8×)；

(ii)对于一个给定的基因组位置，肿瘤和血液样本平均碱基质量值应不小于15；

(iii)变异型应至少被肿瘤标本的20%的总读取数支持,而在血液样本没有高质量的变异支持读取也被认为是变异型；

(iv)在肿瘤组织中，支持突变的序列应不少于三条;

采用上述过滤条件，基于GATK局部重新比对的结果，找出了所有可能的插入或缺失类型体细胞突变；为进一步降低假阳性，用SAMtools软件包来检测肿瘤组织中包括单核苷酸变异和插入与缺失的所有变异，排除了满足以下任何一个过滤条件的所有体细胞变异：

(i)一致序列Phred质量值或SNP质量值<20；

(ii)比对质量值<30；

(iii)只发生于一条DNA链上的变异；

(iv)单碱基替换位点周围30bp范围内存在可疑的插入或者缺失位点。

将所获得的体细胞突变与单核苷酸多态性数据库dbSNP132和1000人基因组计划中获得的SNP数据集进行了比较，排除在上述数据库中记录的所有位点，得到剩余的的变异。

5.根据权利要求1所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，步骤(4)中采用Sanger测序来验证步骤(3)所得突变基因的体细胞替换和插入与缺失的过程为：对肿瘤组织DNA与外周血DNA分别进行PCR扩增，扩增产物经Sanger测序得到突变位点。

6.根据权利要求5所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，PCR扩增的引物为SEQ NO.12～SEQ NO.77所示。

7.根据权利要求5所述的检测STAG2基因突变的方法，其特征在于，PCR扩增的热循环条件为：94℃5分钟酶的活性化反应；94℃30秒、65℃30秒和72℃30秒，共35个循环；72℃10分钟；PCR反应体系为：2μl dNTP、2μl10X PCR Buffer、1μl TF(10μM)、1μl TR(10μM)、1μl DNA模板、12.5μl dH2O(灭菌蒸馏水)和0.5μl TaKaRa Taq HS。