[发明专利]一种利用厌氧条件下发酵生产丁二酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种厌氧条件下利用玉米粉全水解液发酵生产丁二酸的方法。

背景技术

丁二酸又称琥珀酸，是三羧酸循环的中间产物，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。其作为优秀的C₄平台化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯（PBS）类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12 种最有价值的生物炼制品之一。

生物合成丁二酸，是利用细菌，真菌等各种微生物，以葡萄糖或其他各种水解液为碳源，经微生物发酵生产丁二酸。利用微生物发酵法转化可再生资源（葡萄糖、木糖等），由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO₂，能有效缓解温室效应，故成为近年来研究的热点。

玉米是世界上最重要的农作物之一，而中国是生产玉米的大国之一，有着丰富的玉米资源，有报道称，中国的玉米年产量超过1亿吨。另外，据报道，玉米中含有对菌体生长和产酸有促进作用的因子，如生物素、V_B1等。玉米粉是制作葡萄糖的重要原料，但是在过滤工艺之后，也产生了大量的副产物，玉米渣。因此，将廉价而易得的玉米粉及副产物玉米渣充分利用到发酵产丁二酸当中，这必将对发酵生产丁二酸产业化有着重要的意义。

大肠杆菌在氧气缺乏的情况下，丁二酸主要的产生途径为葡萄糖经过糖酵解途经生成磷酸烯醇式丙酮酸，并进而代谢合成草酰乙酸、苹果酸、富马酸，最终以丁二酸的形式积累。G. N. Vemuri等人报道利用大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸的方法，原理是有氧阶段是菌体得到快速积累，然后转为厌氧使菌体产生大量的丁二酸。然而两阶段发酵过程中，需要消耗大量的营养成分用于菌体的生长，导致丁二酸总得率下降，同时由于菌体有氧生长对溶氧要求较高，搅拌及冷却等所需要较高的能耗及成本投入，因此，一步厌氧发酵产丁二酸受到越来越多的关注。然而在专一性厌氧条件下，重组大肠杆菌生产丁二酸需要酵母粉、蛋白胨等复合氮源作为发酵培养基成分，但价格过于昂贵，除此之外，还有菌株生长缓慢，丁二酸终浓度和收率较低等问题未解决。为此，寻找一种在专一性厌氧条件下利用发酵培养基菌株快速生长提高丁二酸终浓度和收率的方法对于发酵生产丁二酸产业化有着突破性的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能使菌株在厌氧条件下无需价格昂贵的酵母粉、蛋白胨等复合氮源作为发酵培养基成分仍能发酵生产得到高浓度和高收率丁二酸的方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案如下：

本发明提供的一种厌氧发酵生产丁二酸的方法，其特征在于所述方法的发酵培养基为玉米粉全水解液。

优选的，所述的玉米粉全水解液包括玉米粉水解所得的葡糖糖水解液和玉米渣水解液。

优选的，所述的葡萄糖水解液为玉米粉经双酶解法水解所得；所述的玉米渣水解液由上述玉米粉双酶法水解过虑后的玉米渣经中性蛋白水解所的。

优选的，所述的玉米粉双酶解法的具体步骤为：将玉米粉与纯水以固体质量分数38 %的比例混合均匀，并加入钙离子，其添加量按照每克原料添加0.000175g钙离子，在pH=6.5，95℃条件下添加7 U/克原料的液化酶，并保温至液化结束；将液化液灭完酶活后在pH=4.5，60℃条件下添加200 U/克原料的糖化酶，并保温48 h，所得糖化液经过滤得到的滤液为葡萄糖水解液；

优选的，所述的玉米渣水解的具体步骤为：将糖化液过滤后的滤渣和纯水按固体质量百分数10%的比例混合，在pH=7.0，55℃条件下添加中性蛋白酶，其添加量为滤渣质量的0.3%，24 h后过滤所得滤液为玉米糖渣水解液，并用凯式定氮法对水解液进行氮含量的测定。

优选的，所述的重组大肠杆菌为重组大肠杆菌AFP111（Escherichia coliAFP111）。

优选的，所述重组大肠杆菌AFP111产丁二酸的方法具体步骤如下：

（1）试管培养：将抗生素和重组大肠杆菌Escherichia coliAFP111接种在5 ml液体LB培养基中厌氧培养，培养温度为37℃，200r/min,培养时间为12 h；

（2）种子培养：将抗生素和试管培养的Escherichia coli AFP111接种到种子培养基中，500ml三角瓶装液量50 ml，有氧培养，培养温度为37℃，200r/min，培养时间为6 h；