[发明专利]一种船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法

说明书

（一）   技术领域

    本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法。

（二）   背景技术

外来生物入侵对我国生态环境和社会发展构成严重威胁，造成了重大的经济损失，抵御外来生物入侵，保护国境安全，是出入境检验检疫刻不容缓的职责和义务。随着海上航运业的快速发展，船舶压载水及沉积物带来的海洋生物入侵问题日益严重，海洋生物入侵会破坏海洋生态系统结构与功能，并造成一定的经济损失。船舶压舱水及沉积物携带的海洋生物可以存活数月，并随着压舱水的排放而进入其他水域，这为不同水域间一些物种的传播提供了一个便利的媒介。外来物种在新的适宜生存环境中的异常繁殖，会对近岸水域的生态系统带来灾难性破坏，甚至导致本土物种的灭绝。20世纪60年代以来北美五大湖共发现40余个外来物种，而旧金山湾在1970年后出现了50多种外来生物。为防止船舶通过压载水及沉积物转移外来生物和病原体，国际海事组织制定《船舶压载水及沉积物控制和管理国际公约》及相关导则。

海洋浮游动物如枝角类、桡足类等，在其生活史阶段会产生休眠细胞以度过不良环境条件，因此可以长时间在船舶压载舱沉积物中存活。如Kelly 对从日本到达美国塔克马和安吉里斯港的木材运输船中的压载水沉积物进行了检测，其中也发现了存活的软体动物幼体和浮游甲壳纲动物。Bailey对进入大湖区9 艘船舶压载舱沉积物中的休眠细胞萌发进行了实验，在孵化出的浮游动物种类中发现4 种外来入侵生物。

目前对沉积物中外来生物的鉴定多依赖于实验室原位萌发实验，对沉积物中休眠细胞萌发后的浮游动物幼体进行形态学鉴定，从而判定是否为入侵生物。该方法耗费时间长，并且要求检验检疫人员具有丰富的生物学分类经验，严重制约船舶压载舱沉积物中外来生物检验检疫工作的开展。而从船舶压载舱沉积物中分离活体细胞并进行分子生物学鉴定，将大大缩短对船舶压载舱沉积物中外来入侵生物进行种类鉴定的时间。

由于浮游动物休眠细胞个体微小（多为直径几十微米），从船舶沉积物压载舱沉积物中分离活体细胞十分困难，因此急需建立一种从船舶压载舱沉积物中快速分离活体细胞的方法。

（三）   发明内容

    本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种步骤简单、检测快速精确的船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，包括如下步骤：

（1）采集船舶压载舱沉积物，放置于培养皿内；

（2）用过滤海水冲洗沉积物至筛绢，用塑料瓶保存冲洗后的液体；

（3）将塑料瓶中的液体冲洗至筛绢，保留筛绢上的残留物；

（4）用饱和蔗糖溶液冲洗筛绢上的残留物到离心管；

（5）将离心管置于台式离心机上离心；

（6）吸取离心管的上清液冲洗至筛绢，保留筛绢上残留物；

（7）用过滤海水漂洗筛绢上的残留物至培养皿，在显微镜下观察活体细胞。

本发明的更优技术方案为：

步骤（2）中，筛绢的孔径为200-250微米；步骤（3）、（4）、（6）和（7）中，筛绢的孔径为30-50微米。

步骤（4）中，饱和蔗糖溶液的组成为200-220克蔗糖/100毫升蒸馏水。

步骤（5）中，离心机转速为1000-1200rpm，离心时间为3-5分钟。

步骤（2）和（7）中，过滤海水为0.15微米滤膜过滤后的海水。

本发明能够从船舶压载舱沉积物中快速分离活体细胞，步骤简单，分离快速，所分离的活体细胞样品可用于出入境检验检疫工作中外来入侵生物的分子生物学物种鉴定。

（四）   具体实施方式

下列实施例是进一步对本发明的说明，不应该当作对本发明的限制。

实施例1：对停靠在烟台芝罘港的船舶压载舱沉积物样品进行活体细胞的快速分离

（1）采集船舶压载舱沉积物，取5克沉积物放置于培养皿内；

（2）用0.45微米过滤海水冲洗沉积物至200微米孔径筛绢，用塑料瓶保存冲洗后的液体；

（3）将塑料瓶中的液体冲洗至50微米孔径筛绢，保留筛绢上的残留物；

（4）用饱和蔗糖溶液冲洗50微米孔径筛绢上的残留物到离心管；

（5）在台式离心机上1000rpm条件下离心3分钟；

（6）吸取离心管的上清液冲洗至50微米孔径筛绢，保留筛绢上残留物；