[发明专利]将黄色颖壳的水稻品种的颖壳颜色改为褐色的育种方法

权利要求书

1.一种将黄色颖壳的水稻品种的颖壳颜色改为褐色的育种方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1、在水稻颖壳颜色决定基因OsCAD2外显子区中选取以碱基NGG结尾的DNA片段作为靶标片段，其中，N代表碱基A、G、C、T中的任意一种，所述靶标片段位于所述OsCAD2基因外显子上；

步骤2、利用所述靶标片段，构建用于水稻OsCAD2基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，其中所述重组载体中包含具有所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框；

步骤3、将所述重组载体导入水稻细胞，诱导含有所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达，剪切OsCAD2基因的双链靶标片段，再通过水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现水稻细胞内OsCAD2基因的功能缺失突变；

步骤4、用导入所述重组载体的水稻细胞再生若干水稻植株；

步骤5、对再生的水稻植株中OsCAD2基因包含所述靶标片段的DNA区段测序；

步骤6、选择两个等位OsCAD2基因都出现功能缺失突变的再生株系，进行表型观察，选取颖壳颜色变褐的株系。

2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述靶标片段中的一条链具有5’-(N)_X-NGG-3’结构，(N)_X表示数目为X的一条碱基序列{N₁,N₂……N_x}，N₁,N₂……N_x中的每一个表示A、G、C、T中的任意一个。

3.根据权利要求2所述的育种方法，其特征在于，X为19或20。

4.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述功能缺失突变为正常OsCAD2编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。

5.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述重组载体包含能够在水稻细胞内表达的向导RNA表达框，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示，所述重组载体还包含能够在水稻细胞内表达的Cas9核酸酶表达框，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

6.根据权利要求5所述的育种方法，其特征在于，

所述向导RNA表达框包括：水稻U6启动子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第1至246位所示；结构特征为(N)_X的靶标序列和人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq ID No.1第267至350位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第351至358位所示。

7.根据权利要求5所述的育种方法，其特征在于，

所述Cas9核酸酶表达框包括玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如Seq ID No.2第1至2031位所示，植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列，其核苷酸序列如Seq ID No.2第2034至6305位所示；以及tNOS终止子，其核苷酸序列如Seq ID No.2第6347至6599位所示。