[发明专利]一种延长水稻生育期的育种方法

说明书

技术领域

本发明属于水稻生物技术育种领域，具体涉及一种延长水稻生育期的育种方法。

背景技术

水稻是我国的第一大粮食作物，目前水稻种植面积为3000万hm²左右，其中杂交水稻种植面积占总水稻面积的57％，杂交稻制(繁)种面积18万hm²左右。杂交稻种子质量的优劣是实现水稻优质、高产和高效生产的基础，杂交稻种子生产水平高低直接关系到我国粮食安全。

杂交水稻种子生产为水稻的异交栽培，即利用杂交稻雄性不育系作母本，雄性不育恢复系作父本，按照一定的行比相间种植，使双亲能够花期相遇，不育系接受恢复系的花粉而授精结实作为杂交种子应用于生产。同时为了保证下年的杂交种子生产，还要利用杂交稻雄性不育系作母本，雄性不育保持系作父本，按照一定的行比相间种植，使其花期相遇，不育系接受保持系的花粉而授精结实作为雄性不育系种子繁殖应用于下年制种。

目前我国的杂交水稻制种技术与研制初期并没有根本的改进，杂交稻制种程序复杂而严格，仍然采用不育系和恢复系差期播种和移栽、人工赶粉、分别仔细收获等，才能防止机械混杂，劳动强度大，因此，杂交稻制种效率不高。并且杂交稻制种产量受技术人员的经验丰富与否及气候条件好坏影响极大，因此，制种效益也不稳定。由于目前我国农村劳动力结构发生了变化，青壮年外出务工，妇女与老年劳力在家务农。因此，积极发展杂交稻机械化制种技术，实现杂交稻制种规模化，是提高我国杂交稻制种效益的必由之路。

不育系和恢复系和生育期一致是实现机械化混播制种的关键。但目前目前绝大多数强优杂交稻组合父母本生育期不一致，主要表现在不育系的生育期短于恢复系，严重的制约了杂交水稻制种的机械化进程。因此，发展可快速定向延长现有水稻不育系生育期的育种方法，对杂交水稻机械化混播制种的推进将有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种延长水稻生育期的育种方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1，在水稻生育期决定基因Ehd3(LOC_Os08g01420)外显子区选取靶标片段，所述靶标片段的双链结构中的一条链具有5’-(N)_X-NGG-3’结构，(N)_X代表数目为X的一段碱基序列{N₁,N₂……N_x}，X代表碱基的数量，N₁,N₂……N_x中的每一个表示A、G、C、T中的任意一个，NGG中的N也表示A、T、G、C中的一种；

步骤2，利用所述靶标片段，构建用于水稻Ehd3基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，其中所述重组载体中包含具有所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框；

步骤3，将步骤2所获的所述重组载体导入水稻细胞，诱导所述向导RNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达；

步骤4，剪切Ehd3基因的双链靶标片段，再通过水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内Ehd3基因的功能缺失突变；

步骤5，用导入所述重组载体的水稻细胞再生水稻植株；

步骤6，对再生的水稻植株中Ehd3基因包含靶标片段的DNA区段测序；

步骤7，选择两个等位Ehd3基因都出现功能缺失突变的再生株系，进行表型鉴定，观察再生株系子代的生育期，挑取生育期显著推迟的株系，作为所创制的生育期推迟的水稻材料。

优选地，X为19或20。

优选地，所述向导RNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框均能够在水稻细胞中表达。

优选地，所述向导RNA表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1所示；所述Cas9核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

优选地，所述向导RNA表达框包括：水稻U6启动子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第1至246位所示；结构特征为(N)X的靶标序列和人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq ID No.1第267至350位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第351至358位所示。