[发明专利]多个microRNAs复合检测的引物设计方法

权利要求书

1.用于microRNAs检测的引物，其特征在于：包括特异性逆转录引物REP、上游引物PF和下游引物PR；所述的特异性逆转录引物REP从5’端到3’端方向依次包括接头序列ADP和P1，所述ADP从5’端到3’端依次为非人类基因组的特殊序列NHS和TTTTC序列，所述P1为与待测miRNA标记3’末端互补的6～8个碱基；所述NHS的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述TTTTC序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的用于microRNAs检测的引物，其特征在于：所述上游引物PF从5’端到3’端方向依次包括非人类基因组序列TAS和P2；所述TAS的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述P2为待测miRNA标记序列中除P1的互补序列以外的碱基序列，且将U替换为T。

3.如权利要求1或2所述的用于microRNAs检测的引物，其特征在于：所述下游引物PR从5’端到3’端方向依次包括非人类基因组序列TAF和NHS；所述TAF的核苷酸序列如SEQ ID No.5。

4.如权利要求1～3任一项所述的用于microRNAs检测的引物，其特征在于：在上游引物PF或下游引物PR的5’端标记荧光物质。

5.用于microRNAs检测的试剂盒，其特征在于：包括特异性逆转录引物REP、上游引物PF和下游引物PR；所述的特异性逆转录引物REP从5’端到3’端方向依次包括接头序列ADP和P1，所述ADP从5’端到3’端依次为非人类基因组的特殊序列NHS和TTTTC序列，所述P1为与待测miRNA标记3’末端互补的6～8个碱基；所述NHS的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述TTTTC序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述上游引物PF从5’端到3’端方向依次包括非人类基因组序列TAS和P2；所述TAS的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述P2为待测miRNA标记序列中除P1的互补序列以外的碱基序列，且将U替换为T。

7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述下游引物PR从5’端到3’端方向依次包括非人类基因组序列TAF和NHS；所述TAF的核苷酸序列如SEQ ID No.5。

8.如权利要求5～7任一项所述的试剂盒，其特征在于：在上游引物PF或下游引物PR的5’端标记荧光物质。

9.检测microRNAs的引物的制备方法，其特征在于：包括特异性逆转录引物REP的制备、上游引物PF的制备和下游引物PR的制备；所述特异性逆转录引物REP的制备包括如下步骤：1)引物序列的确定：确定待检测的miRNA标记的序列信息，采用可与待测miRNA标记3’末端互补的6～8个碱基为逆转录引物中的特异性序列P1，在特异性序列P1的5’末端加上一段接头序列ADP，所述ADP从5’端到3’端依次为非人类基因组的特殊序列NHS和TTTTC序列，所述NHS的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述TTTTC序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；2)制备得到确定序列的引物。

10.如权利要求9所述的检测microRNAs的引物的制备方法，其特征在于：上游引物PF的制备包括如下步骤：1)引物序列的确定：采用待测miRNA标记序列中除前述特异性序列P1的互补序列以外的碱基序列为待测miRNA标记上游的特异性PCR引物P2，并将U替换为T，在待测miRNA标记上游的特异性PCR引物P2的5’末端加上一段非人类基因组序列TAS，TAS的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；2)制备得到确定序列的引物。

11.如权利要求9或10所述的检测microRNAs的引物的制备方法，其特征在于：1)引物序列的确定：从5’端到3’端方向依次包括非人类基因组序列TAF和NHS；所述TAF的核苷酸序列如SEQ ID No.5；2)制备得到确定序列的引物。

12.如权利要求9～11任一项所述的检测microRNAs的引物的制备方法，其特征在于：在上游引物PF或下游引物PR的5’端标记荧光物质。