[发明专利]高效合成S-腺苷同型半胱氨酸的双酶体系及其应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域；具体涉及分子生物技术、基因工程、酶工程、制药工程等技术领域；更具体涉及极耐热性重组酶的高效表达和酶学定性，以及应用这些酶在高温下高效生产S-腺苷同型半胱氨酸的方法。

背景技术

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)是一种氨基酸衍生物，在生物体内与抗病性相关，是对相关病理障碍进行早期诊断的重要指标。外源SAH有镇静剂作用，是有效的安眠药和抗惊厥药物，同时也是1种抗病毒因子。随着SAH在医学领域的广泛研究与应用，其高效生产制备技术也备受关注。

SAH可通过化学方法进行合成，但化学合成方法存在生产条件苛刻，污染环境等缺陷。S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHase）能够催化腺苷和同型半胱氨酸的合成反应，有效地产生SAH；通过酶法制备SAH可提高生产的可操作性和简化产物的下游加工过程。但是，已报道的SAHase的活性和稳定性都不能满足生产的要求。

极端嗜热微生物产生的一类热稳定性酶的高温酶，在酶的生产和应用过程中克服了中温酶（20℃-65℃）及低温酶（2℃-20℃）易于失活的难题，从而极大地降低酶的应用成本，提高生产效率。同时，高温酶基因在常温菌细胞内重组表达后，可通过热处理的方式使宿主细胞的蛋白变性，重组酶得到快速分离纯化。用高温酶在较高的温度下进行生物合成或加工，还有助于提高底物或产物的溶解性，从而加快反应速度、提高产物提取效率。此前，国际上发表过1篇关于海栖热袍菌SAHase的研究论文（Lozada-Ramirez et al. 2013, Appl Biochem Biotechnol 170(3): 639-653）。该文作者没有发现该酶需要辅酶参与催化反应，所报道的SAHase最高活性只有2.45 U/mg，最适反应条件为75℃，pH 6.5；pH 7.0时酶的活性下降约50%，pH 8.0时活性很低，并且在其设定的反应条件下该酶的稳定性极差。

SAHase是一种NAD依赖型酶，在反应过程中需要要消耗大量NAD。由于辅酶的价格高稳定性差，并且，随着辅酶由底物型态转化为产物型态，反应方向逐渐逆转，表观反应速度逐渐停止。因此，辅酶依赖型酶的实际应用，除了必须有合适的酶和反应工艺以外，还需要有效地解决辅酶再生问题。通过双酶的偶联反应，人们有望建立辅酶循环再生体系，达到降低成本和维持快速反应的目的。本实验室研究了海栖热袍菌来源的乳酸脱氢酶的酶学性质，发现该酶具有极高的稳定性， 在宽广的温度和pH值范围内保持较高活性，在NAD再生中具有很大的应用潜力。

发明内容

发明的目的：

为了解决现有SAH制备方法中酶的活性低，稳定性差，NAD消耗快，过程复杂等问题，本发明研制1种用于合成SAH的高活性的高温酶，并利用极耐热性乳酸脱氢酶进行NAD再生，建立高效生产SAH的双酶体系。

技术关键：

从海栖热袍菌中克隆出编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和乳酸脱氢酶的基因并将其分别插入具有自主知识产权的热激表达载体pHsh质粒（美国专利US 7,807,460 B2），在大肠杆菌中进行超量表达产生极耐热性S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和乳酸脱氢酶；对这两种酶分别进行纯化和酶学性质分析，发现它们具有很强的活性和匹配性；随后，运用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和乳酸脱氢酶建立一个高效的SAH的双酶合成方法。

技术方案：

(1) 从海栖热袍菌中克隆出编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和催化NAD再生反应的酶如乳酸脱氢酶的编码基因并将其分别插入热激载体pHsh构建表达质粒pHsh-sahase，和pHsh-ldh。

(2) 对表达质粒中的目标基因的序列进行优化，使目标酶在大肠杆菌细胞中实现超量表达；将优化后的基因表达质粒导入大肠杆菌，通过热激诱导进行表达。

(3) 对重组的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和催化NAD再生反应的酶如乳酸脱氢酶等进行分离纯化（图1）。

(4) 对分离纯化后的各种酶分别进行酶学性质的鉴定，（图2、3）。

(5) 建立用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶制备SAH的单酶合成系统及反应条件。

(6) 以海栖热袍菌来源的极耐热性的酶如乳酸脱氢酶等构建高效的辅酶再生系统，与S-腺苷同型半胱氨酸水解酶联用（图4），提高SAH的合成速度并延长反应周期（图5）。

本发明可取得的有益效果：

本发明的关键有益效果包括：