[发明专利]一种治理土壤重金属污染的复合真菌制剂及其制备方法

权利要求书

1.一种复合真菌菌剂，其特征在于，所述菌剂含有黑附球菌(Epicoccum nigrum，CGMCC No.5775)、Leptosphaerulina chartarum(CGMCC No.5776)、Lecanicillium sp.(CGMCC No.6337)和Peyronellaca pomorum(CGMCC No.6338)四种菌种。

2.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为固体；优选地，所述菌剂中菌体颗粒的粒径为1-3mm，更优选为2mm。

3.根据权利要求1或2所述的菌剂，其特征在于，所述四种菌种的质量比例为1:1:1:1～3:3:2:1。

4.权利要求1-3中任一项所述的菌剂的生产方法，其特征在于，所述方法包括分别培养所述四种菌种，之后将所培养的四种菌种混合。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述分别培养所述四种菌种的方法包括：

(a)一级种子培养；

(b)二级种子培养；

(c)扩大培养；

(d)收集菌体；

(e)任选地，菌体干燥；和

(f)任选地，菌体粉碎。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述扩大培养为固体扩大培养，优选地所述扩大培养在以葡萄糖和蛋白胨为主的琼脂固体培养基中进行，并且优选地，所述扩大培养在大型玻璃圆形培养皿中进行。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

(1)所述一级种子培养为斜面试管一级种子培养：

配制四组无菌斜面试管培养基，其配方1kg培养基包含：为葡萄糖18～23g，蛋白胨8～12g，琼脂12～16g，氯化钠0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.2g，氯化钾0.3～0.6g，余量为水，将已经分离纯化的所述四种菌种分别接种至各组斜面中进行单独培养，培养温度23℃-27℃，优选地24℃-26℃，最优选地25℃，培养4-6天，优选地4.5-5.5天，更优选地5天，菌体长满斜面，分别获得所述四种菌种的一级种子；

(2)所述二级种子培养为Petri dish二级种子培养：

配制四组无菌Petri Dish培养基，其配方为1L培养基中含有无水乙酸钠0.24-0.26g，优选地0.245-0.255g，更优选地0.25g，酵母提取物0.12-0.16g，优选地0.13-0.15g，更优选地0.14g，琼脂12-16g，优选地13-15g，更优选地14g，四水氯化锰300-500μmol/L，优选地350-450μmol/L，更优选地400μmol/L，HEPES4.0-4.2g，优选地4.05-4.15g，更优选地4.1g，余量为去离子水，pH为5-7；

在无菌条件下分别在四组培养基中接入所述四种菌种的一级种子，将所述四种菌种在分离的条件下单独进行培养，培养温度23℃-27℃，优选地24℃-26℃，最优选地25℃，培养时间为7～10天，优选地8-9天，更优选地8.5天，获得所述四种菌种的二级种子；

(3)所述扩大培养为大型玻璃培养皿扩大培养：

配制培养基，其配方为1kg培养基包含：为葡萄糖18～23g，蛋白胨8～12g，琼脂12～16g，碳酸氢钠0.15g，三水磷酸氢二钾0.35g，硫酸镁0.05g，七水硫酸亚铁0.1g，氯化钠0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.2g，氯化钾0.3～0.6g，余量为 水，制成无菌固体培养基，并将所述固体培养基分装至大型玻璃圆形培养皿中；

扩培接种：在无菌条件下分别在四组培养基中接入所述四种菌种的二级种子，将所述二级种子挖取小块接入大型玻璃圆形培养皿中，所述四种菌种在分离的条件下单独进行培养，培养温度为23℃-27℃，优选地24℃-26℃，最优选地25℃，培养时间为9～14天，优选地10-13天，更优选地11-12天，pH为5-8，优选地6-7，更优选地6.5；

(4)收集菌体：

在无菌条件下，将扩培生长完成的所述四种菌种的菌体分别转移至单独的无菌晾架；

(5)菌体干燥

在无菌条件下，将晾架上的菌体通过干燥箱的自然风干进行干燥，干燥温度20℃-25℃，优选地21℃-24℃，更优选地22℃-23℃，湿度在20％以下；

(6)菌体粉碎

在无菌条件下，将自然风干的所述四种菌种的菌体分别放入无菌粉碎机中进行粉碎操作，获得所述四种菌种的粉碎菌体；

(7)混合菌体

分别取所述四种菌种的粉碎菌体，充分混合，获得所述菌剂。