[发明专利]一种高效液相色谱法测定艾塞那肽及其杂质的方法

说明书

技术领域

本发明属分析化学领域，涉及分析检测艾塞那肽及其杂质的方法，特别涉及用一种高效液相色谱法有效分离并测定艾塞那肽及其杂质的方法。 

背景技术

    在艾塞那肽合成、放置、制剂工艺过程中，会产生某些与艾塞那肽结构和性质类似的杂肽（即艾塞那肽杂质），例如缺失肽、非对映异构体等。目前，分离艾塞那肽及其杂质的方法常为反相高效液相色谱法和离子交换色谱法，但这些现公开的反相高效液相色谱法（流动相系乙腈：0.1%三氟乙酸溶液等）方法在艾塞那肽及其杂质测定过程中，专属性差，使得艾塞那肽及其杂质（Exenatide fragment3-39、Acetyl Exenatide、L-Glu¹³ Exenatide、D-Ser⁸ Exenatide、D-Ser¹¹ Exenatide、Met[O] Exenatide、D-His¹ Exenatide、 Des-Gly² Exenatide）的峰不能分离或分离度达不到要求。 

发明内容

    本发明的目的是提供一种高效液相色谱法测定艾塞那肽及其杂质的方法，旨在解决艾塞那肽及其杂质（Exenatide fragment3-39、Acetyl Exenatide、L-Glu¹³ Exenatide、D-Ser⁸ Exenatide、D-Ser¹¹ Exenatide、Met[O] Exenatide、D-His¹ Exenatide、 Des-Gly² Exenatide）的分离并定量测定。

本发明通过以下步骤实现：

1、色谱柱的准备:所用色谱柱的填充剂为用辛烷基硅烷；

2、高效液相色谱仪的设置：检测器的检测波长为214nm，自动进样器温度为6℃，柱温为40℃，流动相流速为0.8~1.2ml/min；

3、色谱流动相水相的配置：称取烷基磺酸钠（庚烷磺酸钠、戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、壬烷磺酸钠、癸烷磺酸钠）适量，用水溶解并稀释成浓度总和为1.2~1.8mmol/L溶液，并用磷酸调pH至4.0~4.8；

所述的烷基磺酸钠可以是庚烷磺酸钠、戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、壬烷磺酸钠、癸烷磺酸钠任意一种或多种的混合物；

所述的烷基磺酸钠的浓度可以是庚烷磺酸钠、戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、壬烷磺酸钠、癸烷磺酸钠一种或多种的混合物的浓度总和； 

4、流动相的准备：以乙腈-上述烷基磺酸钠溶液( 10:90 )为流动相A，乙腈-上述烷基磺酸钠溶液（ 52:48）为流动相B；

5、采用梯度洗脱，洗脱时间及流动相A体积比程序为0.01～60 min从60％→25％、60～60.5min 再从25％→60％、60％运行至65min； 

6、样品溶液的配置：精密称取样品适量，用流动相溶解并稀释至每ml约含艾塞那肽0.4~1.6mg/ml溶液；

7、精密吸取样品溶液40μl，注入液相色谱仪测定，并记录色谱图，在得到的色谱图中，各杂质与主峰均达到良好分离，艾塞那肽的保留时间为26.272min，各杂质Exenatide fragment3-39、Acetyl Exenatide、L-Glu¹³ Exenatide、D-Ser⁸ Exenatide、D-Ser¹¹ Exenatide、Met[O] Exenatide、D-His¹ Exenatide、 Des-Gly² Exenatide的保留时间分别为：8.787min、10.935min、12.109min、13.085min、23.204min、24.855min、28.458min、29.407min，相对保留时间分别为：0.33、0.42、0.46、0.50、0.88、0.95、1.08、1.12。 

本发明通过合理的方法设计，与现有的方法技术相比，具有明显的优点：使分离的已结构确证的杂质达到8个；各杂质的专属性、线性及范围、回收率、精密度、耐用性等试验均良好；仪器设备为已普及的高效液相色谱仪；且流动相配制简单、检测成本低等。

附图说明

 图1是艾塞那肽与各杂质液相分离图。

具体实施方式