[发明专利]一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用。

背景技术

转基因作物是指通过特定方法将来自于动物、植物、微生物等来源的目的基因转移到天然作物中，从而使作物定向获得某种特性并使之能稳定遗传，例如抗除草剂、抗虫、抗逆、抗病等。该技术能克服物种遗传壁垒，改变传统耕作方式，大幅度提升作物产量及品质。第一种转基因作物于1983年首次研发成功，至今已有35科120多种植物成功应用转基因技术，产生了巨大社会经济效益并在提高耕地利用效率、减少农药施用及环境污染、提高人工效率方面产生了巨大推动作用。

对于转基因作物的研究早在20世纪80年代初期就已经开始，至今已经有多种转基因作物的研究报道，涵盖了大部分粮食作物及经济作物，如水稻、玉米、棉花、烟草、番茄、辣椒、大豆、杨树等，目的基因大部分为抗虫，抗除草剂，抗病，抗逆等抗性基因。

草甘膦是一种具有广谱灭生性、内吸传导型除草剂。广泛用于果园、胶园、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后处理，以及出苗后定向处理，是全世界除草剂使用量最大的品种之一。草甘膦具有独特的除草机理，草甘膦是植物莽草酸合成途径关键酶EPSPS的抑制剂，从而打断植物的莽草酸合成途径，植物中的莽草酸含量增加，植物体所必需的芳香族氨基酸合成减弱或停止，随之植物失绿而死亡。草甘膦是一种灭生性除草剂，直接在田间喷施，会对作物产生危害。随着抗草甘膦EPSPS基因的发现和抗草甘膦作物的培育，使草甘膦在田间大量使用成为可能。

草甘膦化学名称N-磷酸甲基甘氨酸(N-(phosphonomethyl)-glyeine)，结构式HO₂CCH₂NHCH₂PO₃H₂分子量为169.1，常态为白色固体，熔点200℃,230℃融化分解，密度0.5g/cm³不可燃，常温能稳定储藏。草甘膦可与碱(有机或无机)生成极易溶于水的盐，而且又不损失其母体化合物的除草活性，草甘膦异丙胺盐是最常用的易容盐，溶解度达500g/L，且不降低草甘膦的毒性。

目前应用最广泛的抗草甘膦转基因棉花是美国孟山都公司，抗农达(草甘膦)棉花(Roundup ReadyCotton)，于1994年通过环境释放许可，1997年开始在主要产棉区推广种植。已商业化的抗农达棉花含有CP4-EPSPS基因。该基因是从Agrobacterium spp中分离出来的对草甘膦不敏感。草甘膦对CP4-EPSPS作用和结合位点与草甘膦对大多数植物中发现的敏感型EPSPS的作用和结合位点是一致的。总体来看，虽然CP4-EPSPS蛋白有50.1％与传统玉米的EPSPS相似，但只有23.3％是完全一致的。因此，通过在草甘膦与PEP(磷酸稀醇式丙酮酸)结合区以外的氨基酸序列变化所引起的构象变化，可以有效降低对草甘膦的亲和性CP4-EPSPS基因插入后，避开了植物体内原有的EPSPS系统，从而使莽草酸代谢得以正常进行，产生了对草甘膦的抗性。目前商业化的抗草甘膦作物大都采用了CP4-EPSPS基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用。

本发明所提供的表达载体，为同时表达草甘膦抗性基因1和草甘膦抗性基因2的环形载体；

所述草甘膦抗性基因1(GR79基因)编码的蛋白质(GR79蛋白)可为下述a1)或a2)：

a1)氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质；

a2)将a1)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与具有草甘膦抗性的蛋白质；

所述草甘膦抗性基因2(GAT基因)编码的蛋白质(GAT蛋白)可为下述b1)或b2)：

b1)氨基酸序列为序列表中序列2所示的蛋白质；

b2)将b1)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与具有草甘膦抗性的蛋白质。

为了便于蛋白的纯化，可在由序列表中序列1或序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列