[发明专利]一种利用实时荧光定量PCR进行谷子锈病早期诊断的技术

说明书

技术领域

本发明涉及用实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR）技术对谷子锈菌进行定量检测，属于植物真菌分子生物学检测技术领域。

背景技术

谷子（Setaria italica）属禾本科（Cramineae）黍亚科（Panicoideae）、黍系（Panicatae）、黍族（Paniceae）、狗尾草亚族（Setaviineae）狗尾草属（Setaria），是我国起源较早的一种作物，在中国北方地区广泛种植。谷子抗旱耐瘠、营养丰富，是我国重要的食品和饲用谷物。但是由于谷子病害的发生，导致谷子产量和质量下降。谷子锈病是世界谷子产区经常发生的一种病害，严重影响谷子生产。锈病流行年份，无论是夏谷区、春谷区还是夏谷与春谷混种区的感病品种产量损失严重，一般减产30%以上，严重地块甚至颗粒不收。

谷子锈病病原菌Uromyces setariae-italicae，属担子菌亚门（Basidiomycotina），单胞锈属（Uromyces）。谷子锈病在谷子的叶片和叶鞘上都可发生，但在叶片上发生更加严重。发病初期，在叶片表面与叶背面，特别是背面产生红褐色斑点，稍隆起，即锈菌的夏孢子堆。叶片上一般可产生许多夏孢子堆，成熟后突破寄主表皮而外露，增强了植株的蒸腾作用，使植株丧失大量水分，减少光合作用面积，严重时夏孢子堆布满叶片，造成叶片枯死。发病后期，在病株的叶背和叶鞘上，尤其叶鞘上散生大量灰黑色小点，即锈菌的冬孢子堆。冬孢子堆大都生长在叶片的腹面或叶鞘上，长期埋生在寄主的表皮下，故症状不明显。谷子锈菌为专性寄生菌，有高度的致病性分化，各地存在不同的生理小种。谷子锈病除为害谷子外，还能侵染青狗尾草、莠狗尾草、倒刺狗尾草、谷莠子、中型狗尾草、轮生狗尾草及印度高野黍等。

由于在病害发生的早期阶段，症状并不明显，用传统的方法很难发现，延误了控制病害的最佳时机。近年来，分子生物学技术的发展为植物体内病原菌的快速、准确诊断提供了有效的工具。实时荧光定量PCR是近几年发展起来的将PCR技术与荧光检测相结合的技术，实现了PCR从定性分析到定量检测的飞跃，通过对荧光信号的采集，达到实时监测PCR过程的目的，从而实现对体系中模板DNA的定量分析。潘娟娟等利用实时荧光定量PCR检测到小麦条锈菌侵入小麦叶片12小时后小麦叶片内的条锈菌含量。M.S. Hamada 等利用实时荧光定量PCR检测并定量小麦茎上的禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）。Ronald J. Sayler 等利用real-time PCR 检测了水稻中立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）AG-1 IA ，灵敏度达到1pg。Bohm等、Gachon等、Mercado-Blanco等也都利用实时荧光定量PCR检测了病原菌在植物体内的变化规律。因此，实时荧光定量PCR技术为快速、准确的检测谷子锈菌提供了技术支持，能够更早、更及时的发现病原菌，对谷子锈病的早期检测和防治具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种通过实时荧光定量PCR技术检测并准确定量谷子中锈菌的方法，通过该方法可快速诊断出谷子植株中是否携带锈菌并得到锈菌的具体含量。该方法能大大缩短检测周期，为锈病的预防和病情的控制提供保障。

本发明的具体步骤是：

1、提取谷子锈菌基因组DNA，以ITS通用引物扩增锈菌基因组DNA，其上游引物和下游引物碱基序列如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。PCR扩增获得727bp的特异性片段，片段回收纯化后与PMD19-T载体连接过夜，通过热激法转入大肠杆菌JM109感受态细胞中，挑取转化菌落进行PCR检测，把插入目的片段的克隆送上海生工进行测序，测序分析后获得该特异片段核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No.3所示。把测定的序列的阳性克隆提取质粒，利用NanoDrop 1000测定质粒浓度，方便后续系列稀释；

2、实时荧光定量PCR引物设计

根据锈菌核糖体ITS序列测序结果，应用Primer Premier 5.0软件设计了特异性引物序列SEQ ID No.4和SEQ ID No.5：

SEQ ID No.4   rustf   GGTGCACTTAATTGTGGCTCAA

SEQ ID No.5   rustr   CTCCTTTTCTTTTTCCCTCTCAAA